Agencia Estatal Boletín Oficial del Estado
Como consecuencia de la plena integración de España en la Comunidad Europea, y de la consiguiente necesidad de armonizar la legislación española con la normativa comunitaria, se publicó la Orden de 23 de mayo de 1989, por la que se aprueba los métodos oficiales de análisis de piensos o alimentos para animales y sus primeras materias.
La posterior promulgación de la Directiva 92/89/CEE, de la Comisión, de 3 de noviembre, por la que se modifica el anexo I de la cuarta Directiva 73/46/CEE, por la que se determina métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales; de las Directivas de la Comisión 92/95/CEE, de 9 de noviembre, y 94/14/CE, de 29 de marzo, por las que se modifica el anexo de la séptima Directiva 76/372/CEE, que establece métodos de análisis comunitarios para el control oficial de piensos; y de las Directivas 93/70/CEE, de la Comisión, de 28 de julio, 93/117/CEE, de la Comisión de 17 de diciembre, por las que se fijan métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales, y 93/28/CEE, de la Comisión, de 4 de junio, por la que se modifica el anexo I de la tercera Directiva 72/199/CEE, por la que se determina métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales, hacen necesaria la aprobación en el ámbito interno de la correspondiente norma de transposición a fin de incorporar los métodos de análisis comunitarios en aquéllas previstos, modificando en lo que es preciso los métodos de análisis inicialmente recogidos en la Orden de 23 de mayo de 1989, ya citada, o añadiendo otros que no están contemplados en ella.
El presente Real Decreto se dicta al amparo de lo dispuesto en el artículo 40.2 de la Ley 14/1986, de 25 de abril, General de Sanidad, y del artículo 149.1.16.ª de la Constitución.
En la tramitación del presente Real Decreto han sido consultadas las entidades y organizaciones del sector afectadas por el mismo.
En su virtud, a propuesta de los Ministros de Agricultura, Pesca y Alimentación, de Sanidad y Consumo, de Economía y Hacienda y de Industria y Energía, previo informe de la Comisión Interministerial para la Ordenación Alimentaria, de acuerdo con el Consejo de Estado y previa deliberación del Consejo de Ministros en su reunión del día 25 de noviembre de 1994,
DISPONGO:
Artículo 1. Objeto.
Se aprueban como oficiales los métodos de análisis de piensos o alimentos para animales y sus primeras materias que se detallan en el anexo.
Artículo 2. Supuesto de inexistencia de métodos oficiales.
Cuando no existan métodos oficiales para determinados análisis de piensos o alimentos para animales y sus primeras materias, y hasta que sean aprobados, podrán ser utilizados los establecidos en normas nacionales vigentes o aquellos métodos internacionales de reconocida solvencia.
Disposición adicional única. Carácter básico.
Lo dispuesto en el presente Real Decreto tiene el carácter de normativa básica estatal en materia de bases y coordinación de la planificación general de la actividad económica y de la sanidad, contenidas en el artículo 149.1.16.ª de la Constitución.
Disposición derogatoria única. Derogación normativa.
Quedan derogadas las disposiciones de igual o inferior rango que se opongan al presente Real Decreto y, en particular, la Orden de 23 de mayo de 1989, por la que se aprueba los métodos oficiales de análisis de piensos o alimentos para animales y sus primeras materias.
Disposición final primera. Facultades de desarrollo.
Se faculta a los Ministros de Agricultura, Pesca y Alimentación, de Sanidad y Consumo, de Economía y Hacienda y de Industria y Energía, para dictar, en el ámbito de sus respectivas competencias, las disposiciones necesarias para el cumplimiento y aplicación de lo dispuesto en el presente Real Decreto.
Disposición final segunda. Entrada en vigor.
El presente Real Decreto entrará en vigor el día siguiente al de su publicación en el «Boletín Oficial del Estado».
Dado en Madrid a 25 de noviembre de 1994.
JUAN CARLOS R.
El Ministro de la Presidencia,
ALFREDO PEREZ RUBALCABA
ANEXO
Métodos oficiales de análisis de piensos
y sus primeras materias
1. Preparación de la muestra para análisis
y disposiciones generales
1.1 Principio. La preparación de las muestras para el análisis debe conseguir que sean lo más homogéneas y representativas posibles.
En general, los métodos de análisis son aplicables a todo tipo de piensos y sus materias primas. Determinados piensos requieren modalidades analíticas particulares, que se prevén en la descripción de los métodos correspondientes.
Cuando estén indicados dos o más métodos para la determinación de un mismo componente de un pienso, la elección del método aplicable, salvo indicación en contrario, corresponderá al laboratorio de control; no obstante, se indicará en el boletín de análisis.
1.2 Material y aparatos. En la descripción de los métodos de análisis únicamente se indican los instrumentos o aparatos especiales o que exigen normas especiales. Se considera superfluo mencionar todos los aparatos o utensilios que forman parte de la instrumentación corriente de los laboratorios de control.
Por lo demás, cuando se haga referencia a agua para las diluciones o lavados, se entenderá siempre que se trata de agua destilada. Análogamente, cuando se haga referencia a una solución, sin más indicaciones, se entenderá que se trata de una solución en agua destilada.
1.3 Reactivos. Todos los reactivos deben ser de calidad contrastada para el método de análisis (p.a.). Para el análisis de oligoelementos la pureza de los reactivos debe ser controlada por una prueba en blanco. Según el resultado se puede requerir una purificación suplementaria.
1.4 Preparación de la muestra-procedimiento. El análisis químico debe hacerse necesariamente sobre una muestra homogénea. Por el contrario, ciertas determinaciones macroscópicas, así como la determinación de la humedad, deben hacerse sobre la muestra en el estado en que se encuentre al llegar al laboratorio. Para tener en cuenta esta doble exigencia, se dividirá la muestra en dos partes. Una de ellas será apartada en el estado en que se encuentra; la otra se preparará para el análisis químico del modo que se indica seguidamente:
Dividir la muestra con ayuda de un aparato mecánico o manualmente, después de haber mezclado cuidadosamente la totalidad en una superficie limpia y seca. En el último caso, es conveniente aplicar el método de los cuartos, que consiste en tomar sucesivamente muestras en dos sectores opuestos. Por último, tomar para el análisis una porción de 100 g aproximadamente y triturar, si es preciso, para que la totalidad pase por un tamiz de luz de malla de 1 mm.
Introducir inmediatamente esta muestra en un recipiente seco provisto de cierre hermético y tapar.
Si la muestra está húmeda, hay que proceder a una predesecación, para que el grado de humedad se sitúe en un valor comprendido entre el 8 y el 12 por 100. Con este fin, desecar la muestra a una temperatura adecuada en el tiempo preciso.
1.5 Resultados. El resultado que se mencionará en el boletín de análisis será el valor medio obtenido a partir de dos determinaciones por lo menos. Salvo disposición en contrario, se expresará en porcentaje de la muestra original, tal como haya llegado al laboratorio. El resultado no debe incluir más cifras significativas que lo que permita la precisión del método de análisis.
1.6 Referencias. Primera Directiva Comunitaria de 15 de junio de 1971. 17/250/CEE. «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 155, de 12 de julio de 1971.
2. Alcaloides en altramuces
2.1 Principio. Los alcaloides son puestos en solución en una mezcla de éter dietílico y de cloroformo, extrayéndose por ácido clorhídrico. Los alcaloides son precipitados por el ácido sílico-túngstico, incinerados y pesados.
2.2 Material y aparatos.
2.2.1 Agitador mecánico.
2.2.2 Cápsula de incineración de platino, cuarzo o porcelana.
2.2.3 Horno de mufla eléctrico.
2.3 Reactivos.
2.3.1 Eter dietílico.
2.3.2 Cloroformo.
2.3.3 Solución de hidróxido sódico 4N.
2.3.4 Acido clorhídrico 0,3N.
2.3.5 Cloruro de sodio.
2.3.6 Solución al 10 por 100 (p/v) de ácido sílico-túngstico (SiO12WO. 26 HO).
2.4 Procedimiento. Pesar, con aproximación de 5 mg, 15 g de la muestra e introducirla en un recipiente de unos 200 ml provisto de tapón esmerilado. Añadir 100 ml de éter dietílico y 50 ml de cloroformo exactamente medidos e inmediatamente y con la ayuda de una bureta graduada, 10 ml de la solución de hidróxido sódico. Agitar vigorosamente al principio para evitar la formación de grumos, continuando la agitación a intervalos; dejar reposar hasta el día siguiente. Si el líquido sobrenadante no está totalmente limpio añadir algunas gotas de agua; filtrar la capa de éter-cloroformo. Recoger 50 ml del filtrado en un matraz aforado de 50 ml y traspasarlos cuantitativamente con la ayuda de 50 ml de éter dietílico a una ampolla de decantación de 150 ml. Extraer tres veces sucesivas con 20 ml de ácido clorhídrico, dejar decantar y recoger el extracto ácido después de cada extracción. Reunir los extractos ácidos en un matraz de 250 ml y eliminar las últimas trazas de éter y del cloroformo calentado ligeramente. Añadir alrededor de 1 g de cloruro de sodio, dejar enfriar y precipitar los alcaloides mediante la solución del ácido sílico-túngstico (2.6.1). Agitar mecánicamente durante 30 minutos, dejar reposar durante una noche, filtrar sobre filtro de cenizas conocidas y lavar el precipitado sucesivamente por dos veces con 10 ml y dos veces con 5 ml de ácido clorhídrico.
Situar el filtro que contiene el precipitado en una cápsula de incineración e incinerar a 900 ºC. Dejar enfriar y pesar.
2.5 Cálculos. Porcentaje de alcaloides = 0,2P.
Siendo:
P = Peso de las cenizas.
Expresar los resultados en porcentaje de la muestra.
2.6 Observaciones. Añadir solución sílico-túngstica hasta que se vea que no se forma más precipitado blanco lechoso del alcaloide.
2.7 Referencias. Primera Directiva Comunitaria de 15 de junio de 1971 (71/250/ CEE). Diario Oficial de las Comunidades Europeas número L 155, de 12 de julio de 1971.
3. Proteína bruta (proteína total)
3.1 Principio. La muestra se mineraliza con ácido sulfúrico en presencia de un catalizador. La solución ácida se alcaliniza mediante una solución de hidróxido sódico. El amoníaco es destilado y recogido en una cantidad medida de ácido sulfúrico, cuyo exceso es titulado por una solución valorada de hidróxido de sodio.
Este método permite determinar el contenido en proteínas brutas de los piensos a partir del contenido en nitrógeno, determinado según el método de Kjeldahl.
3.2 Material y aparatos. Aparatos adecuados para mineralizar, destilar y titular según el procedimiento de Kjeldahl.
3.3 Reactivos.
3.3.1 Sulfato potásico.
3.3.2 Catalizador: Oxido cúprico, CuO, o sulfato cúprico cristalizado pentahidratado, CuSO.5HO.
3.3.3 Zinc granulado.
3.3.4 Acido sulfúrico q = 1,84 g/l.
3.3.5 Acido sulfúrico C (½ HSO) = 0,5 mol/l.
3.3.6 Acido sulfúrico C (½ HSO) = 0,1 mol/l.
3.3.7 Indicador de rojo de metilo: Disolver 300 mg de rojo de metilo en 100 ml de etanol, R = 95-96 por 100 (v/v).
3.3.8 Solución de hidróxido de sodio (puede utilizarse el grado técnico) o = 40 g/100 ml (m/v: 40 por 100).
3.3.9 Solución de hidróxido de sodio, c = 0,25 mol/l.
3.3.10 Solución de hidróxido de sodio, c = 0,1 mol/l.
3.3.11 Piedra pómez en gránulos, lavada con ácido clorhídrico y calcinada.
3.3.12 Acetanilida (punto de fusión = 114 ºC, nitrógeno = 10,36 por 100)
3.3.13 Sacarosa (libre de compuestos nitrogenados).
3.4 Procedimiento.
3.4.1 Mineralización. Pesar 1 g de muestra con una precisión de 0,001 g y transferir dicha cantidad al matraz del aparato mineralizador. Añadir 15 g de sulfato potásico (3.3.1), una cantidad apropiada de catalizador (3.3.2) (0,3 a 0,4 g de óxido cúprico o 0,9 a 1,2 g de sulfato cúprico pentahidratado), 25 ml de ácido sulfúrico (3.3.4) y algunos gránulos de piedra pómez (3.3.11). Homogeneizar. Calentar el matraz primero con moderación y agitando de vez en cuando, si es necesario, hasta la carbonización de la masa y la desaparición de la espuma; después, más intensamente hasta la ebullición regular del líquido. El calentamiento es adecuado cuando el ácido en ebullición se condensa en las paredes del matraz. Evitar el recalentamiento de las paredes y la adhesión sobre ellas de partículas orgánicas. Cuando la solución se vuelva transparente, de color verde claro, mantener la ebullición durante otras dos horas. Después dejar enfriar.
3.4.2 Destilación. Añadir con precaución agua suficiente para disolver completamente los sulfatos. Dejar enfriar y añadir a continuación algunos gránulos de zinc (3.3.3).
Introducir en el matraz colector del aparato destilador 25 ml, medidos con exactitud, de ácido sulfúrico (3.3.5 ó 3.3.6), según el contenido supuesto de nitrógeno y algunas gotas del indicador rojo de metilo (3.3.7).
Conectar el matraz de mineralización al refrigerante del aparato destilador y sumergir la extremidad del refrigerante en el líquido del matraz colector a una profundidad mínima de 1 cm (véase la observación 3.7.3). Introducir lentamente en el matraz de digestión 100 ml de solución de hidróxido de sodio (3.3.8) sin pérdida de amoníaco (3.7.1).
Calentar el matraz hasta la destilación completa del amoníaco.
3.4.3 Titulación. Titular el exceso de ácido sulfúrico del frasco colector mediante la solución de hidróxido de sodio (3.3.9 ó 3.3.10), según la concentración del ácido sulfúrico utilizado, hasta alcanzar el punto final.
3.4.4 Prueba en blanco. Para confirmar que los reactivos están exentos de nitrógeno, efectuar una prueba en blanco (mineralización, destilación y titulación) utilizando 1 g de sacarosa (3.3.13) en lugar de la muestra.
3.5 Cálculo de los resultados. El contenido en proteína bruta se calcula con arreglo a la siguiente fórmula:
(V - V) x c x 0,014 x 100 x 6,25
m
Siendo:
V = Volumen (ml) de NaOH (3.3.9 ó 3.3.10) utilizados en la prueba en blanco.
V = Volumen (ml) de NaOH (3.3.9 ó 3.3.10) utilizados en la titulación de la muestra.
c = Concentración (mol/l) de hidróxido de sodio (3.3.9 ó 3.3.10).
m = Masa (g) de la muestra.
3.6 Comprobación del método.
3.6.1 Repetibilidad. La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas con una misma muestra no debe sobrepasar:
- 0,2 por 100 en valor absoluto, para los contenidos en proteína bruta inferior al 20 por 100.
- 1,0 por 100 en valor relativo sobre el valor más alto, para los contenidos en proteína entre el 20 y el 40 por 100.
- 0,4 por 100 en valor absoluto, para los contenidos superiores al 40 por 100.
3.6.2 Exactitud. Efectuar el análisis (mineralización, destilación y titulación) en 1,5 a 2,0 g de acetanilida (3.3.12) en presencia de 1 g de sacarosa (3.3.13); 1 g de acetanilida consume 14,80 ml de ácido sulfúrico (3.3.5). La recuperación debe ser del 99 por 100, como mínimo.
3.7 Observaciones.
3.7.1 El aparato puede ser manual, semiautomático o automático. Si el aparato exige un trasvase entre mineralización y destilación, dicho trasvase debe realizarse sin pérdida. Si el matraz del aparato de destilación no está provisto de un embudo con llave, añadir la solución de hidróxido inmediatamente antes de conectar el matraz al refrigerante, dejando resbalar el líquido lentamente por las paredes.
3.7.2 Si el producto de la mineralización se solidifica, empezar de nuevo la determinación utilizando una cantidad de ácido sulfúrico (3.3.4) mayor que la especificada anteriormente.
3.7.3 Para los productos con un contenido bajo en nitrógeno, el volumen de ácido sulfúrico (3.3.6) que ha de introducirse en el frasco colector podrá reducirse, si fuera necesario, a 10 ó 15 ml y completarse con agua hasta 25 ml.
3.8 Referencias. Directiva 93/28/CEE. «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» L 179, de 4 de junio de 1993.
4(a) Grasa bruta (sin hidrólisis previa)
4(a).1 Principio. La muestra se extrae con éter de petróleo. El solvente se destila y el residuo se seca y se pesa.
El método permite determinar el contenido en materias grasas brutas en piensos. No es aplicable al análisis de semillas y frutos oleaginosos definidos en el Reglamento número 136/66/CEE, del Consejo, de 22 de septiembre de 1966.
Aplicable a las materias primas de origen vegetal, a excepción de aquellos en que sus materias grasas no son completamente extraíbles con éter de petróleo sin hidrólisis previa. En dichas excepciones se incluyen entre otros los glútenes, las levaduras, las proteínas de soja y las patatas. Este procedimiento se aplica igualmente a los piensos compuestos, con excepción de los que contienen leche en plovo o cuyas materias grasas no son totalmente extraíbles con éter de petróleo sin hidrólisis previa.
4(a).2 Material y aparatos.
4(a).2.1 Extractor. Si el aparato lleva un sifón (tipo Soxhlet) regular el volumen de reflujo de manera que se obtengan al menos 10 ciclos por hora. Si el aparato no tuviera sifón, el volumen de líquido sometido a reflujo será de unos 10 ml por minuto.
4(a).2.2 Cartuchos de extracción, exentos de materias solubles en éter de petróleo, y cuya porosidad sea compatible con las exigencias del punto 4(a).2.1.
4(a).2.3 Estufa de desecación, bien con vacío a 75 ºC ± 3 ºC o bien a presión atmosférica a 100 ºC ± 3 ºC.
4(a).3 Reactivos.
4(a).3.1 Eter de petróleo, intervalo de ebullición: 40 a 60 ºC. El índice de bromo debe ser inferior a 1 y el residuo de evaporación inferior a 2 mg/100 ml.
4(a).3.2 Sulfato de sodio, anhidro.
4(a).3.3 Piedra pómez o perlas de vidrio.
4(a).4 Procedimiento.
4(a).4.1 Pesar, con precisión de 1 mg, 5 g de la muestra e introducirlo con tapón de algodón desgrasado.
Poner el cartucho en el extractor (4(a).2.1) extrayendo durante seis horas con éter de petróleo (4(a).3.1). Recoger el extracto en un matraz seco previamente tarado, en el que haya algunos fragmentos de piedra pómez.
Evaporar el solvente por destilación. Secar el residuo, introduciendo el matraz durante hora y media en estufa de desecación (4(a).2.3). Dejar enfriar en desecador y pesar. Secar de nuevo durante treinta minutos para asegurarse que el contenido en materia grasa permanezca constante (la diferencia en peso entre dos pesadas sucesivas será inferior a 1 mg).
4(a).4.2 Para los productos de elevado contenido en materias grasas, difíciles de triturar o no apropiadas para la toma de una muestra reducida homogénea, proceder como se indica:
Pesar, con precisión de 1 mg, 20 g de la muestra y mezclarlos con 10 g o más de sulfato de sodio anhidro.
Extraer con éter de petróleo (4(a).3.1) según se indica en 4(a).4.1.
Completar el extracto obtenido hasta 500 ml con éter de petróleo (4(a).3.1) y homogeneizar. Introducir 50 ml de la solución en un pequeño matraz seco y tarado, que contenga algunos fragmentos de piedra pómez (4(a).3.3). Eliminar el solvente mediante destilación, secar y continuar con el método operatorio indicado en el último párrafo del punto 4(a).4.1. Valor (a).
Eliminar el disolvente del residuo de extracción que se encuentre en el cartucho. Triturar el residuo a un tamaño de partícula de 1 mm. Colocarlo de nuevo en el cartucho de extracción (no añadir sulfato de sodio) y continuar con el método operatorio, según se indica en los párrafos segundo y tercero del punto (4(a).4.1.). Valor (b).
4(a).5 Cálculos. Según 4(a).4.1, expresar el resultado en porcentaje de la muestra.
Según 4(a).4.2, el contenido en materias grasas brutas en porcentaje de la muestra viene dado por la fórmula:
(10 a + b) x 5
Siendo:
a = Masa, en gramos, del residuo de la primera extracción (parte alícuota del extracto).
b = Masa, en gramos, del residuo de la segunda extracción.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre una misma muestra por el mismo analista no debe rebasar:
- 0,2 por 100 en valor absoluto, para contenidos en materias grasas brutas inferiores al 5 por 100.
- 4,0 por 100 del resultado más alto para los contenidos del 5 al 10 por 100.
- 0,4 por 100 en valor absoluto, para los contenidos superiores al 10 por 100.
4(a).6 Referencias. Directiva de la Comisión de 20 de diciembre de 1983, modificación a la Directiva 71/393/CEE. «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 15/28, de 18 de enero de 1984. Método número 4.
4(b) Grasa bruta (con hidrólisis previa)
4(b).1 Principio. La muestra se trata en caliente con ácido clorhídrico. Dejar enfriar la mezcla y filtrar. Tras haberla lavado y secado, se extrae con éter de petróleo. El solvente se destila y el residuo se seca y se pesa.
El método permite determinar el contenido en materias grasas brutas de los piensos. No es aplicable al análisis de semillas y frutos oleaginosos definidos en el Reglamento número 136/66/CEE, del Consejo, de 22 de septiembre de 1966.
Aplicable a los piensos simples de origen animal, así como a los mencionados en el método 4(a).1, como excepciones a dicho procedimiento.
4(b).2 Material y aparatos. Los mismos que en 4(a).2.
4(b).3 Reactivos.
4(b).3.1 Eter de petróleo, intervalo de ebullición: 40 a 60 ºC. El índice de bromo debe ser inferior a 1 y el residuo de evaporación inferior a 2 mg/100 ml.
4(b).3.2 Acido clorhídrico 3N.
4(b).3.3 Coadyuvante de filtración, por ejemplo tierra de diatomeas.
4(b).3.4 Piedra pómez o perlas de vidrio.
4(b).4 Procedimiento. Pesar, con aproximación de 1 mg, 2,5 g de muestra (para muestras pobres en materias grasas puede aumentarse a 5 g), introducirlos en un vaso de precipitado de 400 ml, o en un erlenmeyer de 300 ml, añadir 100 ml de ácido clorhídrico 3N (4(b).3.2) y algunos fragmentos de piedra pómez. Cubrir el vaso con un vidrio de reloj o conectar al erlenmeyer un refrigerante de reflujo. Llevar la mezcla a ebullición suave, utilizando una pequeña llama o una placa calefactora; mantener la ebullición durante una hora. Evitar que el producto se adhiera a las paredes del recipiente.
Enfriar y añadir suficiente coadyuvante de filtración (4(b).3.3), para evitar la pérdida de materias grasas durante la filtración. Filtrar con doble papel de filtro humedecido, exento de materias grasas. Lavar el residuo con agua fría hasta la neutralidad del filtrado. Comprobar que éste no contenga materias grasas. Su presencia indicaría la necesidad de realizar una extracción de la muestra con éter de petróleo, previa a la hidrólisis, según el método 4(a).
Poner el doble papel de filtro que contiene el residuo sobre un vidrio de reloj y secarlo durante una hora y media en la estufa a 100 ºC ± 3 ºC.
Introducir el doble filtro conteniendo el residuo seco en el cartucho de extracción (4(a).2.2) y cubrirlo con un tapón de algodón desgrasado. Poner el cartucho en el extractor (4(a).2.1) y seguir el modo operatorio indicado en los párrafos segundo y tercero del punto 4(a).4.1.
4(b).5 Cálculos. Como en 4(a).5.1.
4(b).6 Referencias. La misma que en método 4(a).
5. Cloruros
5.1 Principio. Los cloruros se solubilizan en agua, defecándose la solución si contiene materias orgánicas, posterior acidificación de la misma con ácido nítrico y precipitación de los cloruros con nitrato de plata. El exceso de nitrato se valora con una solución de sulfocianuro de amonio. Aplicable a todos los piensos.
5.2 Material y aparatos.
5.2.1 Agitador de 35 a 40 r.p.m.
5.3 Reactivos.
5.3.1 Solución de sulfocianuro de amonio 0,1N.
5.3.2 Solución de nitrato de plata 0,1N.
5.3.3 Solución saturada de sulfato amónico-férrico.
5.3.4 Acido nítrico, d = 1,38.
5.3.5 Eter etílico.
5.3.6 Acetona.
5.3.7 Solución Carrez I: Disolver en agua 24 g de acetato de zinc dihidrato (Zn (CHCOO).2HO) y 3 g de ácido acético glacial. Completar hasta 100 ml con agua.
5.3.8 Solución Carrez II: Disolver en agua 10,6 g de ferrocianuro de potasio trihidrato (K(FeCN)).3HO. Completar a 100 ml con agua.
5.3.9 Carbón activo, exento de cloruros.
5.4 Procedimiento.
5.4.1 Preparación de la solución.
5.4.1.1 Muestras sin materia orgánica. Pesar, con precisión de 1 mg, de 0 a 10 g de la muestra de forma que no contenga más de 3 g de cloro en forma de cloruro e introducirla en un matraz aforado de 500 ml con 400 ml de agua a 20 ºC aproximadamente. Agitar durante treinta minutos, enrasar, homogeneizar y filtrar.
5.4.1.2 Muestras con materia orgánica (menos los citados en 5.4.1.3). Pesar con precisión de 1 mg, aproximadamente 5 g de muestra e introducirla con 1 g de carbón activo en un matraz aforado de 500 ml. Añadir 400 ml de agua a 20 ºC aproximadamente y 5 ml de solución Carrez I, agitar y añadir seguidamente 5 ml de la solución Carrez II. Agitar durante treinta minutos, enrasar, homogeneizar y filtrar.
5.4.1.3 Torta y harina de lino, productos ricos en harina de lino y otros productos ricos en mucílagos o en sustancias coloidales (por ejemplo, almidón hidrolizado).
Preparar la solución como se indica en 5.4.1.2, pero sin filtrar. Decantar (si es necesario centrifugar), separar 100 ml del líquido sobrenadante e introducirlos en un matraz de 200 ml. Mezclar con acetona y enrasar con este disolvente, homogeneizar y filtrar.
5.4.2 Valoración. Tomar de 25 a 100 ml de filtrado (con contenido en cloro inferior a 150 mg) obtenido en 5.4.1.1, 5.4.1.2 ó 5.4.1.3, e introducirlo en un erlenmeyer, diluir si es necesario, hasta 50 ml con agua. Añadir 5 ml de ácido nítrico, 20 ml de solución saturada de sulfato amónico férrico y dos gotas de la solución de sulfocianuro amónico, añadidas mediante una bureta llena hasta el trazo de cero. Añadir seguidamente mediante una bureta la solución de nitrato de plata hasta un exceso de 5 ml. Añadir 5 ml de éter etílico y agitar fuertemente para recoger el precipitado. Valorar el exceso de nitrato de plata mediante la solución de sulfocianuro amónico hasta que el viraje a rojo oscuro persista durante un minuto.
5.5 Cálculos. La cantidad de cloro (p) expresado en cloruro de sodio presente en el volumen del filtrado separado para la valoración viene dada por la fórmula:
P = 5,845 (V1 - V) mg
Siendo:
V = Volumen, en ml, de solución de nitrato de plata añadida.
V = Volumen, en ml, de solución de sulfocianuro amónico 0,1N utilizados en la valoración.
Efectuar un ensayo en blanco sin la muestra a analizar y si consume solución de nitrato de plata 0,1N restar este valor al volumen (V - V).
Expresar el resultado en porcentaje de la muestra.
5.6 Observaciones. Para los productos ricos en materias grasas, desengrasar previamente mediante éter etílico según 4(a).
5.7 Referencias. Primera Directiva de la Comisión de 15 de junio de 1971. (71/250/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 155, de 12 de julio de 1971.
6. Humedad
6.1 Principio. La muestra se deseca en condiciones definidas, variando en función de la naturaleza del producto. La pérdida de masa es determinada por pesada. Es necesario proceder a una predesecación cuando se trata de sustancias sólidas, con un contenido elevado de humedad. No es aplicable a los productos derivados de la leche considerados como piensos simples, sustancias minerales, piensos compuestos constituidos esencialmente de sustancias minerales y semillas y frutos oleaginosos. Para los cereales y sus productos, excepto productos de cereales hidrolizados y raicilla de cebada (6.3.2.2), se aplicará el método oficial para cereales y derivados.
6.2 Material y aparatos.
6.2.1 Molino triturador, fácil de limpiar, que permita una trituración rápida y uniforme, sin provocar calentamientos sensibles ni condensaciones, evitando al máximo el contacto con el aire.
6.2.2 Balanza analítica de precisión 0,5 mg.
6.2.3 Recipientes secos de metal inoxidable o de vidrio, provistos de una tapa que asegure un cierre estanco; superficie útil que permita obtener una distribución de la muestra del orden de 0,3 g por cm.
6.2.4 Estufa isotérmica (± 1 ºC) de calefacción eléctrica, que asegure una regulación rápida de temperatura y convenientemente ventilada.
6.2.5 Estufa de vacío, de calefacción eléctrica regulable, provista de una bomba de aceite o de un dispositivo de introducción de aire caliente deshidratado o de un deshidratante.
6.2.6 Desecador con placa de metal o porcelana, que contenga un deshidratante eficaz.
6.3 Procedimiento.
6.3.1 Preparación de la muestra.
6.3.1.1 Todas las muestras, a excepción de las mencionadas en 6.3.1.2. Separar previamente por lo menos 50 g de la muestra, triturándola o tratándola previamente de forma apropiada, si fuera necesario, para evitar toda variación del contenido en humedad.
6.3.1.2 Alimentos líquidos o pastosos, constituidos esencialmente por materias grasas. Separar previamente y pesar, con aproximación de 10 mg alrededor 25 g de muestra. Añadir una cantidad apropiada de arena anhidra, pesada con aproximación de 10 mg y mezclar hasta obtener un producto homogéneo.
6.3.2 Desecación.
6.3.2.1 Todos los alimentos, a excepción de los mencionados en 6.3.2.2. Tarar, con aproximación de 0,5 mg, un recipiente provisto con tapa. Pesar, con aproximación de 1 mg, en el recipiente tarado unos 5 g de muestra y repartirla uniformemente. Colocar el recipiente, sin tapa, en una estufa previamente calentada a 103 ºC. Para evitar que la temperatura de la estufa no descienda demasiado, introducir el recipiente con rapidez. Dejar secar durante cuatro horas a partir del momento en que la estufa alcance de nuevo la temperatura de 103 ºC. Colocar la tapa sobre el recipiente, retirarlo de la estufa, dejar enfriar de treinta a cuarenta y cinco minutos en un desecador y pesar con aproximación de 1 mg.
En el caso de muestras constituidas esencialmente por materias grasas, efectuar una desecación complementaria de treinta minutos en la estufa a 103 ºC. La diferencia entre las dos pesadas no debe exceder del 0,1 por 100 de humedad.
6.3.2.2 Piensos compuestos que contengan más del 4 por 100 de sacarosa o de lactosa, productos de cereales hidrolizados, raicilla de cebada, garrofa, cabeza de remolacha, azúcares y solubles de pescado y piensos compuestos que contengan más del 25 por 100 de sales minerales con agua de cristalización. Tarar, con una aproximación de 0,5 mg, un recipiente con tapa. Pesar, con una aproximación de 1 mg en el recipiente tarado aproximadamente 5 g de muestra y repartirla uniformemente. Colocar el recipiente en la estufa de vacío previamente calentada a una temperatura de 80 a 85 ºC, sin tapa. Para evitar que la temperatura de la estufa descienda demasiado, introducir el recipiente con rapidez. Llevar la presión a 100 torrs, y dejar secar a esta presión durante cuatro horas, bajo una corriente de aire seco y caliente o con la ayuda de un deshidratante (300 g aproximadamente para 20 muestras). En este último caso, cortar la conexión con la bomba de vacío cuando la presión prescrita se alcance. Contar el tiempo de secado a partir del momento en que la estufa alcance de nuevo la temperatura de 80 a 85 ºC. Llevar con precaución la estufa a la presión atmosférica.
Abrir la estufa, tapar inmediatamente el recipiente y sacarlo. Dejar enfriar durante treinta a cuarenta y cinco minutos en el desecador y pesar con una aproximación de 1 mg. Proceder a una desecación complementaria de treinta minutos en la estufa de vacío a la temperatura de 80 a 85 ºC y pesar de nuevo. La diferencia entre las dos pesadas no debe exceder del 0,1 por 100 de humedad.
6.3.3. Predesecación. Los alimentos sólidos, cuyo contenido en humedad sea elevado y hagan la molienda difícil deben ser predesecados como se indica a continuación:
Pesar con una aproximación de 10 mg unos 50 g de muestra no molida (si es necesario puede hacerse una división previa en el caso de gránulos o aglomerados) en un recipiente adecuado.
Dejar secar en una estufa, a la temperatura de 60 a 70 ºC, hasta que el contenido en humedad sea reducido a un valor comprendido entre 8 y 12 por 100.
Retirar de la estufa, dejar enfriar al aire en el laboratorio durante una hora y pesar con una aproximación de 10 mg. Triturar inmediatamente después como se indica en 6.3.1, y efectuar la desecación como en 6.3.2.1.
6.4 Cálculos. El contenido en humedad, en tanto por ciento de muestra, se obtiene por las fórmulas siguientes:
6.4.1 Desecación sin predesecación:
100 / M (M - m)
Siendo:
M = Masa inicial, en g, de la muestra.
m = Masa, en g, de la muestra seca.
6.4.2 Desecación con predesecación:
(M' - m)M / M' + E - M) 100 / E = 100 (1 - M m / E M')
Siendo:
E=Masa inicial, en g, de la muestra.
M = Masa, en g, de la muestra predesecada.
M'= Masa, en g, de la muestra después de la molienda.
m = Masa, en g, de la muestra seca.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones simultáneas efectuadas sobre una misma muestra no debe sobrepasar el 0,2 por 100 de humedad.
6.5 Referencias. Segunda Directiva de la Comisión de 18 de noviembre de 1971. (71/393/CEE. «Diario Oficial de las Comunidades Europeas», número L 279, de 20 de diciembre de 1971.
7. Determinación de la fibra bruta (celulosa bruta)
7.1 Principio. Determinación en los piensos, de las substancias orgánicas libres de grasa e insolubles en medio ácido y alcalino, convencionalmente denominadas fibra bruta.
La muestra, en su caso desengrasada, se trata sucesivamente con soluciones en ebullición de ácido sulfúrico e hidróxido de potasio, de concentraciones determinadas. Se separa el residuo por filtración mediante filtro de vidrio poroso, se lava, se seca, se pesa y se calcina a una temperatura comprendida entre 475 y 500 ºC. La pérdida de peso debida a la calcinación corresponde a la fibra bruta de la muestra de ensayo.
7.2 Material y aparatos.
7.2.1 Aparatos de calentamiento para la digestión con ácido sulfúrico o solución de hidróxido de potasio, equipado con un soporte para el crisol filtrante (7.2.2) y con un tubo de salida provisto de un grifo para hacer el vacío y evacuar el líquido y, en su caso, con aire comprimido para aplicar contrapresión. Cada día, antes de su utilización, calentarlo previamente con agua hirviendo durante cinco minutos.
7.2.2 Crisol filtrante de vidrio, de 50 ml, con una placa filtrante de vidrio, de porosidad comprendida entre 40 y 90 xm. Antes de utilizarlo por primera vez, calentar a 500 ºC durante algunos minutos y enfriar (7.7.6).
7.2.3 Columna resistente a la ebullición, de 270 como mínimo, con condensador de reflujo.
7.2.4 Estufa de secado con termostato.
7.2.5 Horno de mufla, con termostato.
7.2.6 Aparato de extracción en frío, compuesto por un soporte para el crisol filtrante (7.2.2) y un tubo de descarga provisto de un grifo para hacer el vacío y evacuar el líquido.
7.2.7 Juntas de conexión para unir el aparato de calentamiento (7.2.1), el crisol (7.2.2), y la columna (7.2.3) y conectar el extractor en frío (7.2.6) y el crisol.
7.3 Reactivos.
7.3.1 Acido sulfúrico, c = 0,13 mol/l.
7.3.2 Agente antiespumante (por ej. n-octanol).
7.3.3 Coadyuvante de filtración Celite 545 o equivalente, calentado a 500 ºC durante cuatro horas (véase 7.7.6).
7.3.4 Acetona.
7.3.5 Eter de petróleo ligero-intervalo de ebullición 40-60 ºC.
7.3.6 Acido clorhídrico, c = 0,5 mol/l.
7.3.7 Solución de hidróxido de potasio, c = 0,23 mol/l.
7.4 Procedimiento. Pesar 1 g de muestra con una aproximación de 1 mg, en su caso, previa preparación (véanse 7.7.1, 7.7.2 y 7.7.3), y ponerlo en un crisol (7.2.2) y añadir un gramo de coadyuvante de filtración (7.3.3).
Acoplar el aparato de calentamiento (7.2.1) y el crisol filtrante (7.2.2), y unir a continuación la columna (7.2.3) y el crisol. Poner en el vaso 150 ml de ácido sulfúrico (7.3.1) calentado previamente hasta el punto de ebullición y añadir algunas gotas de antiespumante (7.3.2) en caso necesario. Llevar el líquido a ebullición en 5 ± 2 minutos y dejar hervir enérgicamente durante 30 minutos exactos.
Abrir el grifo del tubo de descarga (7.2.1) y filtrar al vacío el ácido sulfúrico a través del crisol filtrante. Lavar tres veces el residuo del crisol filtrante utilizando 30 ml de agua hirviendo cada vez. Después de cada lavado, secar el residuo del filtro de aspiración.
Cerrar el grifo de salida y añadir a la columna 150 ml de solución de hidróxido de potasio (7.3.7) hirviendo. Añadir unas gotas de antiespumante (7.3.2). Llevar el líquido a ebullición en 5 ± 2 minutos y dejar hervir enérgicamente durante 30 minutos exactos. Filtrar el residuo y lavar tal como se ha indicado para el tratamiento con ácido sulfúrico.
Después del último lavado, secar el residuo por aspiración, desconectar el crisol y su contenido y conectarlo al extractor en frío (7.2.6). Aplicar vacío y lavar tres veces el residuo, en el crisol, utilizando 25 ml de acetona cada vez, secándolo por aspiración después de cada lavado.
Secar el crisol filtrante a 130 ºC en la estufa hasta alcanzar un peso constante. Después de cada secado, enfriar en el desecador y pesar rápidamente. Colocar a continuación el crisol en el horno de mufla y calcinar el contenido a una temperatura comprendida entre 475 y 500 ºC durante 30 minutos como mínimo.
Después de cada calcinación, enfriar, primero en el horno y después en el desecador, antes de pesar.
Realizar una prueba en blanco sin la muestra. La pérdida de peso debido a la calcinación no debe exceder de 4 mg.
7.5 Cálculos.
El contenido en fibra bruta en porcentaje de la muestra se expresa por la fórmula:
(b - c) x 100 / a
Siendo:
a = Masa de la muestra en g.
b = Pérdida de masa por calcinación del residuo de la muestra después de secar a 130 ºC.
c = Pérdida de masa por calcinación del residuo de la prueba en blanco después de secar a 130 ºC.
7.6 Repetibilidad. La diferencia entre dos determinaciones paralelas llevadas a cabo dentro de la misma muestra no debe exceder de:
-0,3 en valor absoluto para contenidos de fibra bruta inferiores al 10 por 100.
-3 por 100 relativo al resultado más alto, para contenidos de fibra bruta iguales o superiores al 10 por 100.
7.7 Observaciones.
7.7.1 Los piensos con un contenido de grasa bruta superior al 10 por 100 deben desengrasarse con éter de petróleo (7.3.5) antes de efectuar su análisis. Conectar el crisol filtrante (7.2.2), con la muestra previamente pesada, al extractor en frío (7.2.6) y lavar tres veces al vacío utilizando 30 ml de éter de petróleo (7.3.5) cada vez. Secar la muestra por aspiración, conectar el crisol con su contenido al aparato de calentamiento (7.2.1) y continuar con arreglo al punto 7.4.
7.7.2 Los piensos que contengan grasas que no puedan extraerse directamente con éter de petróleo (7.3.5) deben desengrasarse con arreglo al punto 7.7.1 y someterse a un nuevo desengrasado después de haber sido tratados con ácido en ebullición.
Después del tratamiento con ácido en ebullición y del lavado, unir el crisol y su contenido al extractor en frío (7.2.6), lavar tres veces utilizando 30 ml de acetona cada vez y a continuación otras tres veces utilizando 30 ml de éter de petróleo cada vez. Secar el filtro por aspiración y continuar el análisis con arreglo al punto 7.4, comenzando con el tratamiento con hidróxido de potasio.
7.7.3 Si los piensos contienen más de un 5 por 100 de carbonatos, expresados en carbonato de calcio, conectar el crisol (7.2.2), con la muestra pesada, al aparato de calentamiento (7.2.1). Lavar la muestra tres veces con 30 ml de ácido clorhídrico (7.3.6). Después de cada adición, dejar reposar la muestra durante un minuto aproximadamente antes de filtrar. Lavar una vez con 30 ml de agua y seguir a continuación con arreglo al punto 7.4.
7.7.4 Si se utiliza una batería de aparatos (varios crisoles unidos al mismo aparato de calentamiento), no deben realizarse dos determinaciones de la misma muestra en la misma serie.
7.7.5 Si, después de la ebullición, resulta difícil filtrar las soluciones ácidas y alcalinas, introducir aire comprimido por el tubo de descarga del aparato de calentamiento y seguir filtrando a continuación.
7.7.6 Con objeto de alargar la duración de los crisoles filtrantes de vidrio, conviene que la temperatura de calcinación no supere los 500 ºC. Asimismo, deben evitarse los cambios térmicos bruscos en los ciclos de calentamiento y enfriamiento.
7.8 Referencias. Directiva 92/89/CEE. «Diario Oficial de las Comunidades Europeas», L 344, de 26 de noviembre de 1992.
8. Azúcares
8.1 Principio. El método permite determinar los azúcares reductores y los azúcares totales previa inversión, expresados en glucosa o, en su caso, en sacarosa, por conversión con ayuda del factor 0,95. Este método es aplicable a los piensos compuestos. Se prevén modalidades especiales para otros alimentos. En su caso, procede determinar por separado la lactosa y tenerlo en cuenta al calcular los resultados.
Defecación a partir de las soluciones de Carrez I y II, previa disolución de los azúcares en etanol diluido. Eliminación del etanol y valoración antes y después de la inversión según el método de Luff-Schoorl.
8.2 Material y aparatos. Agitador mecánico.
8.3 Reactivos:
8.3.1 Etanol al 40 por 100 (v/v) (d = 0,948 a 20 ºC).
8.3.2 Solución Carrez I. Disolver en agua 24 g de acetato de cinc dihidrato y 3 ml de ácido acético glacial y añadir agua destilada hasta 100 ml.
8.3.3 Solución Carrez II. Disolver en agua 10,6 g hexaciano ferrato (II) de potasio (K(FeCN) · 3HO) y añadir agua destilada hasta 100 ml.
8.3.4 Solución de naranja de metilo al 0,1 por 100 (p/v).
8.3.5 Acido clorhídrico 4N.
8.3.6 Acido corhídrico 0,1N.
8.3.7 Solución de hidróxido de sodio 0,1N.
8.3.8 Solución de sulfato de cobre II. Disolver 25 g de sulfato de cobre (CuSO · 5HO) p.a., exento de hierro en 100 ml de agua.
8.3.9 Solución de ácido cítrico. Disolver 50 g de ácido cítrico (CHO · HO) p.a. en 50 ml de agua.
8.3.10 Solución de carbonato de sodio. Disolver 143,8 g de carbonato de sodio anhidro (NaCO) p.a. en 300 ml de agua caliente, dejar enfriar.
8.3.11 Solución de tiosulfato de sodio 0,1N.
8.3.12 Solución de almidón. Añadir una mezcla de 5 g de almidón soluble en 30 ml de agua, a un litro de agua hirviendo. Dejar hervir durante tres minutos. Dejar enfriar. Añadir 10 mg de ioduro mercurio (II) como agente conservador.
8.3.13 Acido sulfúrico 6N.
8.3.14 Solución de ioduro de potasio (KI) al 30 por 100 (p/v).
8.3.15 Piedra pómez hervida con ácido clorhídrico y aclarada con agua.
8.3.16 Isopentanol.
8.3.17 Reactivo de Luff-Schoorl. Verter agitando con cuidado la solución de ácido cítrico (8.3.9) sobre la solución de carbonato de sodio (8.3.10). Añadir inmediatamente la solución de sulfato de cobre (8.3.8) y completar a un litro con agua. Dejar reposar una noche y filtrar. Controlar la normalidad del reactivo obtenido (Cu 0,1N; NaCO2N). El pH de la solución debe ser aproximadamente 9,4.
8.4 Procedimiento.
8.4.1 Preparación de la muestra. Pesar con aproximación de 1 mg 2,5 g de la muestra, e introducirlo en un matraz aforado de 250 ml. Añadir 200 ml de etanol al 40 por 100 (v/v) y mezclar durante una hora en el agitador. Añadir 5 ml de la solución Carrez I y agitar durante un minuto, adicionar y agitar durante el mismo tiempo con 5 ml de la solución de Carrez II.
Enrasar a 250 ml con la solución de etanol 8.3.1, homogeneizar y filtrar. Tomar 200 ml del filtrado y evaporar aproximadamente hasta la mitad del volumen, a fin de eliminar la mayor parte del etanol. Trasvasar en su totalidad el residuo de evaporación con ayuda de agua caliente a un matraz aforado de 200 ml y enfriar, a continuación enrasar con agua y filtrar si es necesario. Esta solución será utilizada para la determinación de azúcares reductores y después de la inversión para la determinación de azúcares totales.
8.4.2 Determinación de azúcares reductores. Tomar como máximo 25 ml de la solución preparada según 8.4.1 y que contenga menos de 60 mg de azúcares reductores, expresado en glucosa. Si es necesario, completar el volumen hasta 25 ml con agua destilada y determinar la cantidad de azúcares reductores según Luff-Schoorl. El resultado será expresado en tanto por ciento de glucosa.
8.4.3 Determinación de azúcares totales previa inversión. Tomar 50 ml de la solución 8.4.1 y llevar a un matraz aforado de 100 ml. Añadir unas gotas de la solución naranja de metilo y adicionar lentamente agitando solución de ácido clorhídrico 4N hasta viraje a rojo. Añadir 15 ml de ácido clorhídrico 0,1N y sumergirlo en un baño de agua caliente a ebullición durante treinta minutos. Refrigerar hasta 20 ºC y añadir a continuación 15 ml de la solución de hidróxido de sodio 0,1N (8.3.7). Enrasar a 100 ml con agua y homogeneizar.
Tomar una cantidad que no exceda de 25 ml y contenga menos de 60 mg de azúcares reductores expresado en glucosa. Si es necesario completar el volumen hasta 25 ml con agua destilada y determinar la cantidad de azúcares reductores según Luff-Schoorl. El resultado será expresado en tanto por ciento de glucosa. De expresarlo en sacarosa se debe de multiplicar por el factor 0,95.
8.4.4 Valoración de Luff-Schoorl. Tomar 25 ml del reactivo Luff-Schoorl (8.3.17) y llevarlo a un erlenmeyer de 300 ml añadir 25 ml exactamente medidos de la solución defecada de azúcares, adicionar un poco de piedra pómez y calentar agitando sobre la llama del mechero. Colocar inmediatamente el erlenmeyer sobre una tela metálica, perforada por una abertura de 6 cm de diámetro y regulando la llama de manera que solamente el fondo del erlenmeyer sea calentado. Adaptar enseguida un refrigerante de reflujo sobre el erlenmeyer, a partir de este momento hacer hervir la solución y mantener en ebullición durante diez minutos exactamente. Refrigerar inmediatamente al chorro de agua fría durante cinco minutos y proceder a su valoración como sigue:
Añadir 10 ml de la solución de ioduro de potasio (8.3.14) inmediatamente después y con cuidado 25 ml de ácido sulfúrico 6N (8.3.13). Valorar a continuación mediante la solución de tiosulfato de sodio 0,1N (8.3.9) hasta la aparición de color amarillo, añadir en este momento la solución de almidón y terminar de valorar.
Efectuar la misma valoración sobre una mezcla que contenga 25 ml exactamente medidos del reactivo de Luff-Schoorl, 25 ml de agua, 10 ml de la solución de ioduro de potasio (8.3.14) y 25 ml de la solución de ácido sulfúrico 6N (8.3.13) sin llevar a ebullición.
8.5 Cálculos. Establecer por medio de la tabla I la cantidad de glucosa en mg correspondiente a la diferencia entre las dos valoraciones, según los ml de tiosulfato de sodio 0,1N gastados en cada una de las valoraciones.
Expresar los resultados en tanto por ciento de la muestra.
8.6 Observaciones.
8.6.1 En caso de piensos muy ricos en melazas o piensos poco homogéneos, pesar 20 g e introducirlos en un matraz aforado de un litro con 500 ml de agua. Mezclar durante una hora en el agitador. Defecar mediante los reactivos de Carrez I y II (8.3.2 y 8.3.3) como se describe en 8.4.1, utilizando de todos los reactivos dosis cuatro veces superiores. Llevar a 1000 ml con etanol del 80 por 100 (v/v) (8.3.1). Homogeneizar y filtrar, a continuación eliminar el etanol según 8.4.1.
En ausencia de almidón exento de productos de hidrolizado, enrasar a 100 ml con agua destilada.
8.6.2 En el caso de melazas y piensos simples, ricos en azúcares y prácticamente exentos de almidón, pesar 5 g e introducirlos en un matraz aforado de 250 ml, añadir 200 ml de agua destilada y mezclar durante una hora o más en el agitador. Defecar inmediatamente por medio de los reactivos de Carrez I y II (8.3.2 y 8.3.3), según 8.4.1.
Llevar a 250 ml con agua, homogeneizar y filtrar, para determinar los azúcares totales, proseguir como 8.4.3.
8.6.3 Es recomendable añadir aproximadamente 1 ml de isopentanol (sin tener en cuenta el volumen) antes de la ebullición, con el reactivo Luff-Schoorl para evitar la formación de espuma.
8.6.4 La diferencia entre la cantidad de azúcares totales después de la inversión, expresada en glucosa y la cantidad de azúcares reductores expresada igualmente en glucosa, multiplicada por 0,95 da la cantidad en tanto por ciento de sacarosa.
8.6.5 Para calcular la cantidad de azúcares reductores, excluyendo la lactosa, se puede determinar de las siguientes formas:
8.6.5.1 Para un cálculo aproximado, multiplicar por 0,675 la cantidad de lactosa obtenida, por determinación separada, y restar el resultado obtenido de la cantidad en azúcares reductores.
8.6.5.2 Para el cálculo preciso de azúcares reductores, excluyendo la lactosa, es necesario partir de la misma muestra 8.4.1 para las dos determinaciones finales. Uno de los análisis es efectuado a partir de la solución obtenida en 8.4.1 y el otro sobre una parte de la solución obtenida para la valoración de la lactosa según el método para la determinación de lactosa.
En los casos 8.6.5.1 y 8.6.5.2 la cantidad de azúcares presentes se determinan según el método de Luff-Schoorl, expresado en mg de glucosa.
La diferencia entre los dos valores se expresa en tanto por ciento de la muestra.
8.7 Referencias. Primera Directiva de la Comisión de 15 de junio de 1971. (71/250/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 155 de 12 de julio de 1971.
TABLA I
Para 25 ml de reactivo Luff-Schoorl
Na2S2O30,1N: ml / Glucosa fructosa azúcares invertidos C6H12O6: mg / Diferencia / Lactosa C12H22O11 : mg / Diferencia / Maltosa C12H22O11 : mg / Diferencia
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23 / 2,4
4,8
7,2
9,7
12,2
14,7
17,2
19,8
22,4
25,0
27,6
30,3
33,0
35,7
38,5
41,3
44,2
47,1
50,0
53,0
56,0
59,1
62,2 / 2,4
2,4
2,5
2,5
2,5
2,5
2,6
2,6
2,6
2,6
2,7
2,7
2,7
2,8
2,8
2,9
2,9
2,9
3,0
3,0
3,1
3,1 / 3,6
7,3
11,0
14,7
18,4
22,1
25,0
29,5
33,2
37,0
40,8
44,6
48,4
52,2
56,0
59,9
63,8
67,7
71,7
75,7
79,8
83,9
88,0 / 3,7
3,7
3,7
3,7
3,7
3,7
3,7
3,7
3,8
3,8
3,8
3,8
3,8
3,8
3,9
3,9
3,9
4,0
4,0
4,1
4,1
4,1 / 3,9
7,8
11,7
15,6
19,6
23,5
27,5
31,5
35,5
39,5
43,5
47,5
51,6
55,7
59,8
63,9
68,0
72,2
76,5
80,9
85,4
90,0
94,6 / 3,9
3,9
3,9
4,0
3,9
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,0
4,1
4,1
4,1
4,1
4,1
4,2
4,3
4,4
4,5
4,6
4,6
9. Acidez de la grasa
Esta determinación será aplicable a aquellas grasas que se utilicen como materia prima.
El procedimiento será el que figura en el método número 10 de las Métodos Oficiales de Análisis de Aceites y Grasas aprobados por Orden de 31 de enero de 1977
(«Boletín Oficial del Estado» de 14 de julio de 1977).
En el caso de que fuera necesario preparar la muestra se seguirá el procedimiento recogido en el método número 1 de la mencionada Orden.
10. Calcio
10.1 Principio. El método permite determinar el contenido en calcio total de los piensos.
La muestra se incinera, las cenizas se tratan con ácido clorhídrico y el calcio se precipita en forma de oxalato de calcio. Después de disolver el precipitado en ácido sulfúrico, el ácido oxálico formado se valora mediante una solución de permanganato de potasio.
10.2 Material y aparatos.
10.2.1 Matraz aforado de 250 ml de capacidad.
10.2.2 Erlenmeyer de 250 ml de capacidad.
10.2.3 Crisol de platino, cuarzo o porcelana.
10.2.4 Crisoles filtrantes de vidrio, porosidad G4.
10.2.5 Horno eléctrico con circulación de aire y regulador automático, para regular a 550 ºC.
10.2.6 Baño de agua.
10.3 Reactivos.
10.3.1 Acido clorhídrico d = 1,14, p.a.
10.3.2 Acido nítrico d = 1,40, p.a.
10.3.3 Acido sulfúrico d = 1,13, p.a.
10.3.4 Amoníaco d = 0,98, p.a.
10.3.5. Solución saturada de oxalato amónico en frío, p.a.
10.3.6 Solución al 30 por 100 (p/v) de ácido cítrico, p.a.
10.3.7 Solución al 5 por 100 (p/v) de cloruro de amonio, p.a.
10.3.8 Solución al 0,04 por 100 (p/v) de verde de bromocresol.
10.3.9 Solución de permanganato potásico; 0,1N, p.a.
10.4 Procedimiento. Pesar con aproximación de 1 mg, 5 g de la muestra a analizar (o más si es necesario), calcinarla a 550 ºC y trasvasar las cenizas a un erlenmeyer de 250 ml. Añadir 40 ml de ácido clorhídrico (10.3.1), 60 ml de agua y algunas gotas de ácido nítrico (10.3.2). Llevar a ebullición y mantenerlo así durante treinta minutos. Enfriar, trasvasar la solución a un matraz aforado de 250 ml, enjuagar el erlenmeyer y completar el volumen con agua, homogeneizar y filtrar.
Tomar con una pipeta según la cantidad presumible de calcio, una alícuota que contenga de 10 a 40 mg de calcio e introducirla en un erlenmeyer de 250 ml. Añadir 1 ml de la solución de ácido cítrico (10.3.6) y 5 ml de solución de cloruro de amonio (10.3.7). Completar el volumen a 100 ml aproximadamente con agua. Llevar a ebullición, añadiendo de 8 a 10 gotas de solución de verde de bromocresol (10.3.8) y 30 ml de solución caliente de oxalato de amonio (10.3.5). Si aparece un precipitado, disolver éste mediante la adición de algunas gotas de ácido clorhídrico (10.3.1).
Neutralizar después muy lentamente con amoníaco (10.3.4), agitando constantemente, hasta obtener un pH 4,4-4,6 (viraje del indicador). Colocar el erlenmeyer en un baño de agua hirviendo durante treinta minutos, dejando reposar el precipitado formado. Retirarlo del baño, dejarlo reposar durante una hora y filtrar en un crisol filtrante G4. Lavar el erlenmeyer y el crisol con agua hasta la total eliminación del exceso de oxalato de amonio (la ausencia de cloruros en el agua de lavado indica que el lavado es suficiente).
Disolver el precipitado sobre el filtro con 50 ml de ácido sulfúrico caliente (10.3.3), enjuagar el crisol con agua caliente hasta llevar el filtrado a 100 ml aproximadamente. Calentar a 70-80 ºC y valorar mediante la solución de permanganato de potasio (10.3.9) hasta la obtención de una coloración rosa persistente durante un minuto.
10.5 Cálculo. 1 ml de permanganato de potasio 0,1N corresponde a 2,004 mg de calcio.
Expresar el resultado obtenido en tanto por ciento de la muestra.
10.6 Observaciones.
10.6.1 Para pequeñas cantidades de calcio, proceder como en 10.5. Filtrar el precipitado de oxalato de calcio sobre un papel de filtro sin cenizas y calcinarlo en un crisol a 550 ºC. Recuperar el residuo con algunas gotas de ácido sulfúrico (10.3.3), evaporar a sequedad, calcinar de nuevo a 550 ºC y pesar.
Si P representa el peso de sulfato cálcico obtenido, la cantidad en calcio de la alícuota tomada será igual a P x 0,2944.
10.6.2 Si la muestra está constituida exclusivamente de materias minerales, proceder a la disolución por ácido clorhídrico sin incineración previa. Para los productos tales como los fosfatos alumínico-cálcicos difíciles de disolver en los ácidos, proceder a una fusión alcalina antes de la disolución. Mezclar íntimamente en un crisol la parte tomada con cinco veces su peso de una mezcla compuesta en partes iguales de carbonato de potasio y de carbonato de sodio. Calentar con precaución hasta la fusión completa de la mezcla. Refrigerar y disolver con ácido clorhídrico.
10.6.3 Si la cantidad en magnesio de la muestra es elevada, proceder a una segunda precipitación de oxalato de calcio.
10.7 Referencias. Primera Directiva de la Comisión de 15 de junio de 1971. (71/250/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 155, de 12 de julio de 1971.
11. Grasa
11.1 Principio. Determinación de la grasa por el método Gerber.
11.2 Material y aparatos.
11.2.1 Butirómetros contrastados, con graduaciones de 0 a 6 por 100 de grasa y con divisiones del 0,1 por 100. Se pueden utilizar butirómetros con graduaciones de 0 a 5 por 100 y divisiones del 0,1 por 100, cuando la muestra tenga un contenido en grasa inferior al 5 por 100.
11.2.2 Tapones troncocónicos de goma u otro tipo, apropiados.
11.2.3 Pipetas contrastadas de 1 y 10 ml.
11.2.4 Vidrios de reloj.
11.2.5 Baño de agua regulable a 65 ± 1 ºC.
11.2.6 Centrífuga capaz de alcanzar 1.200 r.p.m.
11.2.7 Embudo desprovisto de cuello y vástago, para la introducción de la muestra en el butirómetro.
11.3 Reactivos.
11.3.1 Acido sulfúrico de densidad d = 1,82.
11.3.2 Alcohol isoamílico de densidad d = 0,815 e intervalo de destilación de 128 ºC a 132 ºC.
11.4 Procedimiento.
11.4.1 Pesar, con precisión de 0,1 mg, 1,100 g de producto e introducirlo en el butirómetro a través del embudo. Añadir, a través del embudo, 10 ml de agua tibia (40 ºC), arrastrando lo que haya podido adherirse al mismo. Tapar y agitar fuertemente para disolver la leche.
Seguidamente añadir 10 ml de ácido sulfúrico, haciéndolo resbalar suavemente por las paredes del butirómetro. Añadir 1 ml de alcohol isoamílico. Cerrar el butirómetro con el tapón de goma, agitar suavemente y centrifugar a 1.200 r.p.m. durante tres a cinco minutos. Sacar el butirómetro de la centrífuga e introducir en el baño de agua a 65 ºC. Dejar transcurrir algunos minutos y efectuar la lectura.
11.5 Expresión de los resultados. Leer en el butirómetro, en la escala dividida, la altura que ha alcanzado la columna de grasa, habiéndose ajustado a cero el líquido que no contiene grasa. Los grados de la escala indican las decenas, y las décimas las unidades por ciento. Se puede apreciar perfectamente un 0,5 por 100.
11.6 Observaciones.
11.6.1 En el caso de sueros desprovistos de caseína, pueden producir carbonizaciones que dificultan la lectura (debido a que el ácido sulfúrico de densidad d = 1,82 resulta demasiado concentrado). En este caso se puede diluir al 10 por 100 (v/v) con agua destilada.
11.6.2 En los productos con grasa muy micronizada, conviene repetir por tres veces las centrifugaciones, el calentamiento a 65 ºC y las lecturas, hasta obtener resultados constantes.
11.7 Referencias. Instituto de Racionalización y Normalización del Trabajo. Una Norma Española, 64.029.
12. Cenizas brutas
12.1 Principio. Incineración de la muestra a 550 ºC y pesada del residuo hasta peso constante.
12.2 Material y aparatos.
12.2.1 Placa calefactora.
12.2.2 Horno eléctrico con regulación de temperatura.
12.2.3 Crisoles de platino o cuarzo, rectangulares (60 x 40 x 25 mm) o redondos (diámetro: 60 a 75 mm, altura: 20 a 25 mm).
12.2.4 Nitrato de amonio: Solución al 20 por 100 (p/v).
12.3 Procedimiento. Pesar alrededor de 5 g de muestra, con una aproximación de 1 mg (para los productos que tengan tendencia a esponjarse pesar 2,5 g en un crisol previamente calcinado y tarado). Colocar el crisol sobre la placa calefactora hasta carbonización de la muestra. Introducir el crisol en el horno regulado a 550 ± 5 .ºC. Mantener a esta temperatura hasta la obtención de cenizas blancas, gris claro o rojizas, aparentemente desprovistas de partículas carbonosas. Colocar el crisol en un desecador, dejar enfriar y pesar inmediatamente.
12.4 Cálculos. El porcentaje de cenizas sobre materia natural se obtiene por la fórmula siguiente:
Cenizas % (materia natural) = (P1- P2) 100 / P - P2 100
Siendo:
P = Peso, en g, de la cápsula con la muestra.
P = Peso, en g, de la cápsula con las cenizas.
P = Peso, en g, de la cápsula vacía.
12.5 Observaciones.
12.5.1 Las materias difíciles de incinerar deben someterse a una primera incineración de tres horas, se enfrían y se les adiciona algunas gotas de una solución al 20 por 100 de nitrato de amonio. Continuando la incineración después de la desecación en estufa.
Repetir eventualmente la operación hasta incineración completa.
12.5.2 Para las materias resistentes al tratamiento anterior, operar como sigue: Después de una incineración de tres horas, arrastrar las cenizas con agua caliente y filtrar sobre un pequeño filtro de cenizas conocidas. Incinerar el filtro y su contenido en el crisol inicial.
Llevar el filtrado al crisol frío, evaporar a sequedad, incinerar y pesar.
12.5.3 En el caso de aceites y grasas, pesar 25 g en un crisol de capacidad apropiada. Carbonizar inflamando la muestra por medio de una mecha de papel de filtro sin cenizas. Después de la combustión humedecer con la mínima cantidad de agua posible. Desecar y continuar como se indica en 12.5.
12.6 Referencias. Primera Directiva de la Comisión de 15 de junio de 1971. (71/250/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 155, de 12 de julio de 1971.
13(a) Bases nitrogenadas volátiles (nitrógeno
amoniacal) (por microdifusión)
13(a).1 Principio. El método permite determinar el contenido en bases nitrogenadas volátiles, expresadas en amoníaco, de los piensos para animales.
La muestra se extrae con agua, la solución se defeca y se filtra. Las bases nitrogenadas volátiles se desplazan con una solución de carbonato de potasio por microdifusión, se recogen en una solución de ácido bórico y se valora con ácido sulfúrico.
13(a).2 Material y aparatos.
13(a).2.1 Mezclador: de aproximadamente 35 a 40 oscilaciones por minuto.
13(a).2.2 Células de Conway (v. esquema), de vidrio o de material plástico.
13(a).2.3 Microburetas, graduadas a 1/100 ml.
(FIGURA OMITIDA)
13(a).3 Reactivos.
13(a).3.1 Solución al 20 por 100 (p/v) de ácido tricloroacético.
13(a).3.2 Indicador: disolver 33 mg de verde de bromocresol y 65 mg de rojo de metilo en 100 ml de etanol al 95-96 por 100.
13(a).3.3 Solución de ácido bórico. En un matraz aforado de 1 litro, disolver 10 g de ácido bórico p.a. en 200 ml de etanol al 95-96 por 100 y 700 ml de agua. Añadir 10 ml de indicador (13(a).3.2.). Mezclar y ajustar si fuera necesario, la coloración de la solución al rojo claro por adición de una solución de hidróxido de sodio. 1 ml de esta solución permite fijar como máximo 300 g de NH3.
13(a).3.4 Solución saturada de carbonato de potasio: disolver 100 g de carbonato de potasio p.a. en 100 ml de agua en ebullición. Dejar enfriar y filtrar.
13(a).3.5. Acido sulfúrico 0,02N.
13(a).4 Procedimiento. Pesar, con precisión de 1 mg, 10 g de la muestra e introducirlos en un matraz aforado de 200 ml con 100 ml de agua. Mezclar durante 30 minutos en el mezclador. Añadir 50 ml de solución de ácido tricloroacético (13(a).3.2), completar el volumen con agua, agitar vigorosamente y filtrar sobre un filtro de pliegues.
Introducir con la pipeta en la parte central de la célula de Conway 1 ml de solución de ácido bórico (13(a).3.3) y en la corona de la célula 1 ml del filtrado de la muestra. Cubrir parcialmente con ayuda de la tapa engrasada. Dejar caer rápidamente en la corona 1 ml de solución saturada de carbonato de potasio (13(a).3.4) y cerrar la tapa herméticamente. Remover con precaución la célula proporcionándole un movimiento de rotación al plano horizontal, con objeto de garantizar la mezcla de los dos reactivos. Dejar incubar bien durante cuatro horas por lo menos a la temperatura ambiente o bien durante una hora a 40 ºC.
Valorar las bases volátiles en la solución de ácido bórico con ácido sulfúrico 0,02N (13(a).3.5) empleando una microbureta (13(a).2.3).
Efectuar una prueba en blanco aplicando el mismo método operatorio.
13(a).5 Cálculos de los resultados. 1 ml de ácido sulfúrico 0,02N corresponde a 0,34 mg de amoníaco.
Expresar el resultado en porcentaje de la muestra.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre una misma muestra no debe exceder del 10 por 100 en valor relativo para los contenidos en amoníaco inferiores al 1,0 por 100; 0,1 en valor absoluto para los contenidos en amoníaco iguales o superiores al 1,0 por 100.
13(a).6 Observaciones. Si el contenido en amoníaco de la muestra fuera superior al 0,6 por 100 diluir el filtrado inicial.
13(a).7 Referencias. Segunda Directiva de la Comisión de 18 de noviembre de 1971. (71/393/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 279, de 20 de diciembre de 1971.
13(b) Bases nitrogenadas volátiles
13(b).1 Principio. El método permite determinar el contenido de bases nitrogenadas volátiles, expresadas en amoníaco, de las harinas de pescado que no contengan prácticamente urea. Unicamente es aplicable para contenidos en amoníaco inferiores al 0,25 por 100.
La muestra se extrae con agua, la solución se defeca y se filtra. Las bases nitrogenadas volátiles se desplazan por ebullición mediante adición de óxido de magnesio y se recogen en una cantidad conocida de ácido sulfúrico cuyo exceso se valora con una solución de hidróxido de sodio.
13(b).2 Material y aparatos.
13(b).2.1 Mezclador de 35 a 40 oscilaciones por minuto aproximadamente.
13(b).2.2 Aparato de destilación del tipo Kjeldahl.
13(b).3. Reactivos.
13(b).3.1 Solución al 20 por 100 (p/v) de ácido tricloroacético.
13(b).3.2 Oxido de magnesio, p.a.
13(b).3.3 Emulsión de antiespuma (por ej., silicona).
13(b).3.4 Acido sulfúrico 0,1N.
13(b).3.5 Solución de hidróxido de sodio 0,1 N.
13(b).3.6 Solución al 0,3 por 100 (p/v) de rojo de metilo en etanol del 95-96 por 100.
13(b).4 Procedimiento. Pesar con precisión de 1 mg, 10 g de la muestra e introducirlos con 100 ml de agua en un matraz aforado de 200 ml. Mezclar durante 30 minutos en el mezclador. Añadir 50 ml de solución de ácido tricloroacético (13(b).3.1), completar el volumen con agua, agitar con fuerza y filtrar sobre un filtro de pliegues.
Tomar una cantidad de filtrado límpida en función del contenido supuesto en bases nitrogenadas volátiles (100 ml son suficientes, en general). Diluir en 200 ml y añadir 2 g de óxido de magnesio (13(b).3.2) y algunas gotas de emulsión antiespuma (13(b).3.3). La solución debe ser alcalina en el papel de tornasol; si no lo es, añadir óxido de magnesio (13(b).3.2). Destilar 150 ml aproximadamente de la solución en un aparato del tipo Kejldahl y recoger el destilado en un erlenmeyer que contenga un volumen exactamente medido (25 a 50 ml) de ácido sulfúrico 0,1N (13(b).3.4). Durante la destilación, evitar un recalentamiento de las paredes. Llevar la solución sulfúrica a ebullición durante dos minutos, enfriar y valorar el exceso de ácido sulfúrico con la solución de hidróxido de sodio 0,1N (13(b).3.5) en presencia del indicador rojo de metilo (13(b).3.6).
Efectuar un ensayo en blanco aplicando el mismo método operatorio.
13(b).5 Cálculos. 1 ml de ácido sulfúrico 0,1N corresponde a 1,7 mg de amoníaco.
Expresar el resultado en porcentaje de muestra.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre una misma muestra no debe exceder, en valor relativo, del 10 por 100 de amoníaco.
13(b).6 Referencias. Segunda Directiva de la Comisión de 18 de noviembre de 1971. (71/393/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 279, de 20 de diciembre de 1971.
14. Carbonatos
14.1 Principio. Descomposición de los carbonatos mediante la acción del ácido clorhídrico y comparación del volumen de anhídrido carbónico desprendido frente a una cantidad conocida de carbonato cálcico medido en las mismas condiciones.
14.2 Material y aparatos.
14.2.1 Aparato de Scheibler-Dietrich, según figura en 14.1.
14.3 Reactivos.
14.3.1 Acido clorhídrico, d = 1,10.
14.3.2 Carbonato de calcio.
14.3.3 Solución de ácido sulfúrico 0,1N o aproximado, coloreada con rojo de metilo.
14.4 Procedimiento. Según la concentración en carbonatos de la muestra pesar: 0,5 g cuando la riqueza esté comprendida entre el 50 y 100 por 100 expresado en carbonato cálcico.
1 g cuando la riqueza esté comprendida entre el 10 y el 50 por 100 expresado en carbonato cálcico.
2 g a 3 g cuando la riqueza sea inferior al 10 por 100 expresado en carbonato cálcico.
Una vez pesada la cantidad idónea de muestra a analizar introducirla en el frasco (4) del aparato de Scheibler-Dietrich, el cual estará provisto de un pequeño tubo de material irrompible conteniendo 10 ml de la solución 14.3.1. Conectar a continuación el frasco con el aparato. Girar la llave (5) de tres vías de forma que el tubo (1) comunique con el exterior.
Por medio del tubo móvil (2), que está lleno de ácido sulfúrico coloreado (14.3.3) y unido al tubo graduado (1), llevar el nivel del líquido a la graduación de cero. Girar la llave (5) de modo que haga comunicar los tubos (1) y (2) y comprobar el nivel a cero.
Previa inclinación del frasco (4), dejar pasar lentamente todo el ácido clorhídrico (14.3.3) sobre la muestra. Igualar la presión bajando el tubo (2). Agitar el frasco (4) hasta que cese por completo el desprendimiento del gas carbónico.
Restablecer la presión reduciendo el líquido al mismo nivel en los tubos (1) y (2). Hacer la lectura pasados unos minutos, hasta que el volumen gaseoso permanezca constante.
Efectuar en las mismas condiciones un ensayo comparativo con 0,5 g de carbonato de calcio (14.3.2).
14.5 Cálculos.
% CO3Ca = V . 100:T . 2P Siendo:
V = Volumen, en ml, de CO desprendido por la muestra.
T = Volumen, en ml, de CO desprendido por 0,5 gramos de COCa (14.3.2).
P = Peso, en gramos, de la muestra.
14.6 Observaciones.
14.6.1 Cuando la muestra tomada es superior a 2 gramos introducir previamente 15 ml de agua destilada en el frasco (4) y mezclar antes de comenzar el análisis. Emplear el mismo volumen de agua para el análisis comparativo.
14.6.2 Si se utiliza un aparato de un volumen diferente al de Scheibler-Dietrich, es necesario adaptar la cantidad de muestra tomada de la ebullición y la sustancia a comparar, así como el cálculo de resultados.
14.7 Referencias. Primera Directiva de la Comisión de 15 de junio de 1971. 71/250/CEE. «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 155, de 12 de julio de 1971.
(FIGURA OMITIDA)
FIGURA 14.1. (Escala 1/8 en mm)
Aparato según Scheibler-Dietrich para determinar el CO
15(a) Aflatoxina B (cromatografía
monodimensional en capa fina)
15(a).1 Principio. El método permite determinar el contenido en aflatoxina de las materias primas y piensos simples. Este método no puede ser utilizado en presencia de pulpas de cítricos. El límite inferior de determinación es 0'01 mg/kg (10 ppb).
En presencia de sustancias interferentes que dificulten las determinaciones, se volverá a iniciar el análisis según el método 15(b) (por cromatografía de líquidos de alta resolución).
15(a).2 Material y aparatos.
15(a).2.1 Triturador-mezclador.
15(a).2.2 Aparato para agitar o agitador magnético.
15(a).2.3 Filtros plegados, Schleicher y Schüll número 588 o equivalente, diámetro: 24 cm.
15(a).2.4 Columnas para cromatografía (diámetro interior: 22 mm, longitud 300 mm), con grifo de teflón y capacidad de 250 ml.
15(a).2.5 Aparato rotativo de evaporación en vacío, con matraz de 500 ml.
15(a).2.6 Frascos cónicos de 500 ml, con tapón esmerilado.
15(a).2.7 Equipo para cromatografía en capa fina.
15(a).2.8 Placas de vidrio para cromatografía en capa fina, 200 x 200 mm, preparadas de la siguiente manera (con las cantidades indicadas se pueden recubrir cinco placas): introducir 30 g de gel de sílice G-HR (15(a).3.1.15) en un frasco cónico, añadir 60 ml de agua, tapar y agitar durante un minuto. Extender la suspensión en las placas con objeto de obtener una capa uniforme de 0,25 mm de espesor. Dejar secar al aire y conservar después en un desecador provisto de gel de sílice. En el momento de su utilización, activar las placas manteniéndolas durante una hora en la estufa a 110 ºC. Las placas ya listas para su utilización son prácticas en la medida en que dan resultados parecidos a los de las placas preparadas según se ha indicado.
15(a).2.9 Lámpara ultravioleta de ondas largas (360 nm). La intensidad de irradiación debe permitir distinguir, incluso con claridad, una mancha de 1,0 ng de aflatoxinas B en una placa para cromatografía en capa fina, a una distancia de 10 cm de la lámpara.
15(a).2.10 Tubos de 10 ml, graduados, con tapones de polietileno.
15(a).2.11 Espectrofotómetro ultravioleta.
15(a).2.12 Fluordensitómetro (eventualmente).
15(a).3 Reactivos.
15(a).3.1 Acetona.
15(a).3.2 Cloroformo estabilizado por 0,5 al 1 por 100 de etanol del 96 por 100 (v/v).
15(a).3.3 n-Hexano.
15(a).3.4 Metanol.
15(a).3.5 Eter dietílico anhidro, exento de peróxidos.
15(a).3.6 Mezcla de benceno y acetonitrilo 98/2 (v/v).
15(a).3.7 Mezcla de cloroformo (15(a).3.2.) y de metanol 97/3 (v/v).
15(a).3.8 Gel de sílice, para cromatografía en columna granulométrica 0,05 a 0,20 nm.
15(a).3.9 Algodón previamente desengrasado, mediante cloroformo, o lana de vidrio.
15(a).3.10 Sulfato de sodio anhidro.
15(a).3.11 Gas inerte, por ejemplo, nitrógeno.
15(a).3.12 Solución de ácido clorhídrico 1N.
15(a).3.13 Solución de ácido sulfúrico al 50 por 100 (v/v).
15(a).3.14 Tierra de diatomeas lavada con ácido.
15(a).3.15 Gel de sílice para cromatografía en capa fina.
15(a).3.16 Solución patrón de 0,1 microgramos, aproximadamente de aflatoxina B por mililitro en el cloroformo (15(a).3.2) o en la mezcla de benceno/acetonitrilo (15(a).3.6), preparada y controlada como se indica en 15(a).6.
15(a).3.17 Solución patrón cualitativa de 0,1 microgramos aproximadamente de aflatoxinas B y B por ml por el cloroformo (15(a).3.2) o en la mezcla benceno/acetonitrilo (15(a).3.6). Estas concentraciones se dan a título indicativo y deben ajustarse con objeto de obtener la misma intensidad de fluorescencia para las dos aflatoxinas.
15(a).3.18 Disolventes de desarrollo.
15(a).3.18.1 Cloroformo (15(a).3.2) / acetona (15(a).3.1): 9/1 (v/v), cubeta no saturada.
15(a).3.18.2 Eter dietílico (15(a).3.5) / metanol (15(a).3.4) / agua: 96/3/1 (v/v/v), cubeta no saturada.
15(a).3.18.3 Eter dietílico (15(a).3.5) / metanol (15(a).3.4) / agua: 94/4,5/1,5 (v/v/v), cubeta saturada.
15(a).3.18.4 Cloroformo (15(a).3.2) / metanol (15(a).3.4): 94/6 (v/v), cubeta saturada.
15(a).3.18.5 Cloroformo (15(a).3.2) / metanol ((15(a).3.4): 97/3 (v/v), cubeta saturada.
15(a).4 Procedimiento.
15(a).4.1 Preparación de la muestra. Proceder como se indica en el método oficial número 1.
Las muestras que contengan más de un 5 por 100 de materias grasas deben desengrasarse con éter de petróleo (punto de ebullición 40-60 ºC) tras la preparación indicada en 15 (a).5.1. En estos casos, los resultados del análisis se expresarán en peso de la muestra no desengrasada.
15(a).4.2 Extracción. Introducir 50,0 g de la muestra molida y homogeneizada en un frasco cónico de 500 ml (15(a).2.6). Añadir 25 g de tierra de diatomeas (15(a).3.14), 25 ml de agua y 250 ml de cloroformo (15(a).3.2.). Tapar el frasco, sacudir o agitar durante 30 minutos con ayuda del aparato (15(a).2.2) y filtrar mediante filtro plegado (15(a).2.3). Eliminar los diez primeros ml del resultado de la filtración y recoger a continuación 50 ml.
15(a).4.3 Purificación en columna. Proveer la extremidad inferior de la columna para cromatografía (15(a).2.4) de un tapón de algodón o de lana de vidrio (15(a).3.9), llenar los tercios del tubo de cloroformo (15(a).3.2) y añadir 5 g de sulfato de sodio (15(a).3.10).
Comprobar que la superficie superior de la capa de sulfato de sodio está plana; añadir a continuación, en pequeñas porciones, 10 g de gel de sílice (15(a).3.8).
Remover con precaución después de cada adición con el fin de eliminar las burbujas de aire. Dejar que se pose durante quince minutos y añadir seguidamente, con precaución, 15 g de sulfato de sodio (15(a).3.10). Dejar descender el líquido hasta la proximidad inmediata de la superficie superior de la capa de sulfato de sodio.
Mezclar los 50 ml de extracto recogidos en 15(a).4.2 con 100 ml de n-hexano (15(a).3.3) y transvasar cuantitativamente la mezcla en la columna. Dejar descender el líquido hasta la superficie superior de la capa de sulfato de sodio. Eliminar el líquido filtrado. Añadir a continuación 100 ml de éter dietílico (15(a).3.5) y dejar descender de nuevo el líquido hasta la superficie superior de la capa de sulfato de sodio. Durante estas operaciones, procurar que el flujo sea de 8 a 12 ml por minuto y que la columna no se vacíe. Eliminar los líquidos filtrados. Eluir después mediante 150 ml de la mezcla cloroformo-metanol (15(a).3.7) y recoger la totalidad del eluido.
Evaporar éste casi a sequedad bajo una corriente de gas inerte (15(a).3.11) y a una temperatura que no supere los 50 ºC, mediante el aparato rotativo de evaporación en vacío (15(a).2.5). Introducir cuantitativamente el residuo por medio de cloroformo (15(a).3.2) o de la mezcla benceno/acetonitrilo (15(a).3.6) en un tubo de 10 ml (15(a).2.10). Concentrar la solución bajo una corriente de gas inerte (15(a).3.11) y llevar después el volumen a 2,0 ml por medio de cloroformo (15(a).3.2) o de la mezcla benceno/acetonitrilo (15(a).3.6).
15(a).4.4 Cromatografía en capa fina. Depositar puntualmente en una placa para cromatografía en capa fina (15(a).2.8), a 2 cm del borde inferior y a intervalos de 2 cm, los volúmenes de la solución patrón y del extracto indicados a continuación:
- 10, 15, 20, 30 y 40 microlitros de la solución patrón de aflatoxina B (15(a).3.16).
- 10 microlitros del extracto obtenido en (15(a).4.3) y, en superposición en el mismo punto, 20 microlitros de la solución patrón (15(a).3).
- 10 y 20 microlitros del extracto obtenido en (15(a).4.3).
Desarrollar el cromatograma fuera del alcance de la luz, con ayuda de uno de los disolventes de desarrollo (15(a).3.16). La elección del disolvente debe determinarse previamente depositando en la placa 25 microlitros de la solución patrón cualitativa (15(a).3.17) y asegurándose de que, durante el desarrollo, las aflatoxinas B y B están completamente separadas:
- El 25 por 100 del resultado más elevado para los contenidos en aflatoxina B de 10 a 20 microgramos/kilogramo.
- 5 microgramos, en valor absoluto, para los contenidos de 20 a 50 microgramos/kilogramo.
- El 10 por 100 del resultado más elevado para los contenidos superiores a 50 microgramos/kilogramo.
15(a).5 Preparación y control de la solución patrón (15(A).3.16).
15(a).5.1 Determinación de la concentración en aflatoxina B.
Preparar una solución patrón de aflatoxina B en el cloroformo (15(a).3.2) o en la mezcla benceno/acetonitrilo (15(a).3.6) cuya concentración es de 8 a 10 microgramos por mililitro. Determinar el espectro de absorción entre 330 y 370 nm con ayuda de un espectrofotómetro (15(a).2.11).
Medir la absorbancia (A) a 363 nm en el caso de la solución clorofórmica y a 348 nm en el caso de la solución en la mezcla benceno/acetonitrilo.
Calcular la concentración en microgramos de aflatoxina B por mililitro de solución a partir de las siguientes fórmulas:
312 · A · 1000 para la solución clorofórmica
312 · A · 1000 para la solución clorofórmica
206000 para la solución clorofórmica
312 · A · 1000
312 · A · 1000 para la solución en la mezcla
19800 benceno/acetonitrilo
Fuera del alcance de la luz, efectuar las diluciones convenientes para obtener una solución patrón de trabajo cuya concentración en aflatoxina B es de 0,1 microgramos aproximadamente por mililitro.
Conservada en el refrigerador, dicha solución permanece estable durante dos semanas.
15(a).5.2 .Control de la pureza cromatográfica.
Depositar en una placa (15(a).2.8), 5 microlitros de la solución patrón de 8-10 microgramos de aflatoxina B por mililitro (15(a).6.1).
Desarrollar el cromatograma según se ha indicado en (15(a).4.4). Con la luz ultravioleta, la fluorescencia sólo debe dar lugar a la percepción de una sola mancha y no debe percibirse ninguna fluorescencia en la zona del depósito de origen.
(FIGURA OMITIDA)
15(a).5.3 Reproducibilidad de los resultados del método A. La reproducibilidad de los resultados, es decir, la variación entre los resultados obtenidos por dos o más de laboratorios con la misma muestra, se ha calculado en:
± 50 por 100 del valor medio de los resultados para los valores medios de aflatoxina B de 10 a 20 xg/kg
± 10 xg/kg del valor medio para los valores medios entre 20 a 50 xg/kg.
± 20 por 100 del valor medio para los valores medios superiores a 50 xg/kg.
15(a).5.4 Referencias.
Directiva 92/95 CEE. «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» L 327, de 9 de noviembre.
Directiva 94/14/CEE. «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» L 94, de 13 de abril.
15(b) Determinación de la aflatoxina B, mediante
cromatografía de líquidos de alta resolución
15(b).1 Principio. El método se basa en la separación mediante cromatografía de líquidos de alta resolución con detección por fluorescencia. La extracción de la muestra se realiza con cloroformo. Se filtra el extracto y una parte alícuota de éste se purifica en un cartucho de florisil y, a continuación, en un cartucho C. La separación y determinación finales se realizan mediante cromatografía de líquidos de alta resolución (CLAR) utilizando una columna de fase inversa C seguida de una reacción post-columna con solución acuosa de yodo y detección por fluorescencia.
El método permite determinar aflatoxina B en los piensos, incluidos los que contienen pulpa de cítricos. El límite inferior de determinación es de 0,001 mg/kg.
Nota: Las micotoxinas son extremadamente tóxicas. Las manipulaciones deben llevarse a cabo en campana extractora de humos. Deben tomarse precauciones especiales cuando las toxinas están en forma sólida, ya que debido a su naturaleza electrostática tienden a dispersarse en las áreas de trabajo.
15(b).2 Material y aparatos. Atención: El uso de material de vidrio que no se haya lavado con ácido, para las soluciones acuosas de aflatoxinas, puede originar pérdidas de aflatoxinas. Deberán tomarse precauciones especiales con el material de vidrio nuevo o desechable. Por ejemplo los frascos para muestreador automático y las pipetas Pasteur. Por lo tanto, el material de vidrio que vaya a estar en contacto con las soluciones acuosas de aflatoxinas deberá sumergirse durante varias horas en un ácido diluido (por ejemplo, ácido sulfúrico, c = 2 mol/l) y, a continuación, lavarse a fondo con agua destilada para suprimir todo resto de ácido (por ejemplo, tres enjuagues, seguidos de una comprobación con papel pH). En concreto, este tratamiento deberá aplicarse a los matraces redondos (15(b).2.4), a los matraces aforados, probetas, a los frascos o tubos utilizados para soluciones para calibración y extractos finales (en particular, los frascos para muestreador automático) y a las pipetas Pasteur si se utilizan para transferir soluciones para calibración o extractos.
15(b).2.1 Triturador/Mezclador.
15(b).2.2 Tamiz de malla de 1,0 mm (ISO R 565).
15(b).2.3 Agitador mecánico.
15(b).2.4 Evaporador rotatorio a vacío provisto de un matraz redondo de 150 ml a 250 ml.
15(b).2.5 Cromatógrafo de líquidos de alta resolución, con bucle de inyección que permita inyectar 250 xl.
Ver instrucciones del fabricante para el llenado parcial o total del bucle.
15(b).2.6 Columna analítica para CLAR: relleno C de 3 ó 5 xm.
15(b).2.7 Bomba libre de pulsos que suministre el reactivo yodado para la reacción postcolumna, por ejemplo, bomba para CLAR o concebida para reacción postcolumna.
15(b).2.8 Conexión en T Valco de volumen muerto nulo, de acero inoxidable (1/16" x 0,75 mm).
15(b).2.9 Serpentín de reacción, de teflón o de acero inoxidable. Las dimensiones comprendidas entre 3.000 x 0,5 mm y 5.000 x 0,5 mm resultan apropiadas en combinación con columnas CLAR de 5 ó 3 xm. 15(b).2.10 Baño de agua termostatizado a 60 "ºC, con una variación de temperatura de menos de 0,1 ºC.
15(b).2.11 Detector de fluorescencia que proporcione longitudes de onda de excitación de 365 nm aproximadamente y de emisión de 435 nm aproximadamente. (Para los aparatos de filtro: longitud de onda de emisión 400 nm). Deberá ser posible efectuar la detección de 0,05 ng de B, como mínimo. Se recomienda aplicar cierta contrapresión (por ejemplo, un constrictor o una espiral de teflón o acero inoxidable conectada al orificio de salida del detector) a fin de suprimir las burbujas de aire en la célula de flujo.
15(b).2.12 Registrador de banda de papel.
15(b).2.13 Integrador electrónico (facultativo).
15(b).2.14 Filtro de pliegues 24 cm. Macherey-Nagel 617 1/4 o equivalente.
15(b).2.15 Filtro de membrana con un tamaño de poro de 0,45 xm, Millipore HAWP 04700 o equivalente.
15(b).2.16 Erlenmeyer de 500 ml con tapón de vidrio.
15(b).2.17 Columna de vidrio (con un diámetro interior de 1 cm aproximadamente y una longitud de 3 cm aproximadamente) provisto de una punta Luer.
15(b).2.18. Llave Luer de nailon resistente al cloroformo (por ejemplo, Bio-rad 7328017, Analytichem A1 6078, J.T. Baker 4514 o equivalente).
15(b).2.19 Jeringa de 10 ml resistente a productos químicos, con llave Luer.
15(b).2.20 Jeringa de 250 xl adecuada para la inyección en CLAR (Ver 15(b).2.5).
15(b).2.21. Microjeringa de 100 xl para la preparación de soluciones de calibración (comprobar, mediante pesada, que su precisión es del 2 por 100).
15(b).2.22 Tubos calibrados de 10,0 ml con tapón de vidrio.
15(b).2.23 Espectrofotómetro adecuado para realizar medidas en la región U.V. del espectro.
15(b).2.24. Equipo para efectuar la prueba de confirmación (15(b).5).
15(b).2.24.1 Embudo de decantación de 100 ml (con llave de teflón), lavado con ácido.
15(b).2.24.2 Fuente de calor a 40-50 ºC.
15(b).3 Reactivos.
15(b).3.1 Cloroformo estabilizado con 0,5 a 1,0 por 100 de etanol, en masa.
Ver 15(b).9.2.
15(b).3.2 Metanol, grado CLAR para preparación de 15(b).3.6.
15(b).3.3 Acetona.
15(b).3.4 Acetonitrilo, grado CLAR.
15(b).3.5 Disolventes de elución; preparar un día antes de su utilización o eliminar mediante ultrasonidos el aire que contengan.
15(b).3.5.1 Mezcla de acetona (15(b).3.3) y agua, 98 + 2 (v/v).
15(b).3.5.2 Mezcla de agua y metanol (15(b).3.2), 80 + 20 (v/v).
15(b).3.5.3 Mezcla de agua y acetona (15(b).3.3), 85 + 15 (v/v).
15(b).3.6 Fase móvil para CLAR. Mezcla de agua, metanol (15(b).3.2) y acetonitrilo (15(b).3.4), 130 + 78 + 40 (v/v/v).
Nota: Puede ser necesario ajustar la composición de los disolventes de la fase móvil, de acuerdo con las características de la columna CLAR utilizada.
15(b).3.7 Solución acuosa saturada de yodo. Añadir 2 g de yodo a 400 ml de agua. Mezclar durante 90 minutos como mínimo y filtrar a través de un filtro de membrana (15(b).2.15). Proteger de la luz la solución saturada, a fin de evitar la fotodegradación.
15(b).3.8 Celite 545 lavada con ácido, o equivalente.
15(b).3.9 Cartucho de florisil (Waters SEP-PAK) o equivalente.
15(b).3.10 Cartucho C18 (Waters SEP-PAK) o equivalente.
15(b).3.11 Gas inerte, por ejemplo, nitrógeno.
15(b).3.12 Solución patrón de aflatoxina B en cloroformo con una concentración de 10 xg/ml. Comprobar la concentración de la solución del siguiente modo: Determinar el espectro de absorción de la solución citada entre 330 y 370 nm por medio del espectrofotómetro (15(b).2.23). Medir la absorbancia (a) en el máximo cercano a 363 nm. Calcular la concentración de Aflatoxina B en microgramos por mililitro de solución, empleando la fórmula siguiente:
Concentración (xg/ml) = 312 · A · 1000 = 13,991 · A
Concentración (xg/ml) = 312 · A · 1000 = 13,991 · A
Concentración (xg/ml) = 22300 = 13,991 · A
15(b).3.12.1 Solución madre de aflatoxina B en cloroformo. Transferir cuantitativamente 2,5 ml de solución patrón de aflatoxina B (15(b).3.12) a un matraz aforado de 50 ml y enrasar con cloroformo. Almacenar esta solución en un lugar fresco (4 ºC) al abrigo de la luz, adecuadamente tapada y envuelta en una hoja de aluminio (15(b).3.13). Soluciones de aflatoxina B para calibración de CLAR.
Nota: Para la preparación de estas soluciones deberá utilizarse material de vidrio lavado con ácido (véase el punto 15(b).2. Aparatos).
15(b).3.13.1 Solución para calibración de 4 ng/ml. Dejar reposar (algunas horas) la solución madre (15(b).3.12.1), contenida en el matraz aforado envuelto en la hoja de aluminio, hasta que alcance la temperatura ambiente. Transferir 400 xl de la solución madre (200 ng aflatoxina B) a un matraz aforado de 50 ml y evaporar la solución hasta sequedad en corriente de gas inerte (15(b).3.11). Disolver el residuo obtenido en 20 ml aproximadamente de mezcla de agua y acetona (15(b).3.5.3), enrasar con la misma mezcla y homogeneizar.
15(b).3.13.2 Solución para calibración de 3 ng/ml. Transferir cuantitativamente 7,5 ml de solución para calibración (15(b).3.13.1) a un matraz aforado de 10 ml con la mezcla de agua y acetona (15(b).3.5.3) y homogeneizar.
15(b).3.13.3 Solución para calibración de 2 ng/ml. Transferir cuantitativamente 25 ml de la solución para calibración (15(b).3.13.1) a un matraz aforado de 50 ml, enrasar con la mezcla de agua y acetona (15(b).3.5.3) y homogeneizar. Esta solución se denomina también «Patrón de referencia» y se usa, en particular, para efectuar inyecciones repetidas durante el procedimiento de CLAR.
15(b).3.13.4 Solución para calibración de 1 ng/ml. Transferir cuantitativamente 2,5 ml de solución para calibración (15(b).3.13.1) a un matraz aforado de 10 ml, enrasar con la mezcla de agua y acetona (15(b).3.5.3) y homogeneizar.
15(b).3.14. Una mezcla de aflatoxina B, B, G y G en concentraciones aproximadas de 1; 0,5; 1 y 0,5 xg/ml, respectivamente, en 1ml de cloroformo.
15(b).3.14.1 Solución de comprobación cromatográfica. Transferir la mezcla (15(b).3.14) a un tubo de ensayo con tapón de vidrio o a un frasco con tapón de rosca. Transferir 40 æl de esta solución a un tubo de ensayo con tapón de vidrio -lavado con ácido- (15(b).2.22). Evaporar el cloroformo en una corriente de gas inerte (15(b).3.11) y disolver de nuevo en 10 ml de la mezcla de agua y acetona (15(b).3.5.3).
15(b).3.15 Reactivos para la prueba de confirmación (15(b).5). 15(b).3.15.1 Solución acuosa saturada de cloruro de sodio.
15(b).3.15.2 Sulfato de sodio anhidro, granular.
15(b).4 Procedimiento.
15(b).4.1 Preparación de la muestra. Triturar la muestra de manera que pueda pasar a través del tamiz (15(b).2.2).
15(b).4.2 Porción de ensayo. Pesar en el erlenmeyer (15(b).2.16) 50,0 g de la muestra problema preparada.
15(b).4.3 Extracción. Añadir a la porción de ensayo 25 g de Celite (15(b).3.8) 250 ml de cloroformo (15(b).3.1) y 25 ml de agua. Tapar el matraz y agitar durante treinta minutos en el agitador mecánico (15(b).2.3). Filtrar a través de filtro de pliegues (15(b).2.14). Recoger 50 ml de filtrado. Si fuera necesario, tomar una alícuota del fitrado y diluir a 50 ml con cloroformo de forma que la concentración de aflatoxina B no sea mayor de 4 ng/ml.
15(b).4.4. Purificación (el procedimiento debe seguirse sin interrupciones significativas). Deberán tomarse las siguientes precauciones:
- Proteger convenientemente de la luz natural el laboratorio de análisis.
Para ello se pueden utilizar:
1) Hojas que absorban los rayos UV para cubrir las ventanas y una luz tamizada (evítese la luz solar directa).
2) Cortinas o persianas en combinación con luz artificial (pueden utilizarse tubos fluorescentes).
- Proteger todo lo posible de la luz las soluciones que contengan aflatoxina (conservar en la oscuridad y utilizar hojas de aluminio).
15(b).4.4.1 Purificación con SEP-PAK de florisil.
15(b).4.4.1.1. Preparación del conjunto columna-cartucho. Acoplar una llave (15(b).2.18) a la rama más corta de un cartucho de florisil (15(b).3.9) (véase la figura 15(b).1).
Lavar el cartucho y eliminar el aire tomando con una jeringa (15(b).2.19) 10 ml de cloroformo (15(b).3.1) y haciendo pasar rápidamente 8 ml de cloroformo por la llave a través del cartucho. Unir la rama más larga del cartucho a la columna de vidrio (15(b).2.17) e introducir en la columna a través del cartucho los 2 ml de cloroformo restante. Cerrar la llave y sacar la jeringa. 15(b).4.4.1.2. Purificación. Introducir en el conjunto columna-cartucho el filtrado recogido con arreglo al punto (15(b).4.3) y dejar escurrir por gravedad. Lavar con 5 ml de colroformo (15(b).3.1) y, a continuación, con 20 ml de metanol (15(b).3.2). Desechar los eluatos. Durante estas operaciones, evitar que el conjunto columna-cartucho se quede seco. Eluir aflatoxina B con 40 ml de la mezcla acetona/agua (15(b).3.5.1) y recoger la totalidad del eluato en el matraz redondo (150 ml) del evaporador rotatorio (4.4). Concentrar el eluato en el evaporador rotatorio a una temperatura de 40-50 ºC hasta que cese la destilación de acetona.
Nota: En ese momento quedan en el matraz 0,5 ml de líquido aproximadamente. Se ha demostrado experimentalmente que el continuar la evaporación no tiene consecuencias nocivas y que cuando quedan 0,5 ml de líquido la cantidad de acetona presente no es significativa. La presencia de residuos de acetona podría provocar pérdidas de la aflatoxina B en el cartucho C. Añadir 1 ml de metanol (15(b).2.2), agitar el matraz para disolver la aflatoxina B adherida a sus paredes, añadir 4 ml de agua y mezclar. Desconectar y desechar el cartucho. Lavar con agua la columna de vidrio y conservada para efectuar la purificación C.
15(b).4.4.2 Purificación con SEP-PAK C.
15(b).4.4.2.1 Preparación del conjunto columna-cartucho. Acoplar una llave (15(b).2.18) a la rama más corta de un cartucho C ((15(b).3.10). (Véase la figura 1(b).1.)
Purgar el cartucho y extraer el aire haciendo pasar rápidamente con una jeringa (15(b).2.19) 10 ml de metanol (15(b).3.2) por la llave a través del cartucho. (Las burbujas de aire del cartucho son visibles en forma de manchas de luz sobre un fondo grisáceo.) Tomar 10 ml de agua y hacer pasar 8 ml a través del cartucho (evítese introducir aire cuando se pase del metanol al agua). Unir la rama más larga del cartucho a una columna de vidrio e introducir en la columna a través del cartucho los 2 ml de agua restantes. Cerrar la llave y sacar la jeringa.
15(b).4.4.2.2 Purificación. Transferir cuantitativamente a la columna (15(b).2.17) el extracto recogido en el punto ((15(b).4.4.1.2), lavando dos veces el matraz con 5 ml de la mezcla de agua y metanol (15(b).3.5.2) y dejar escurrir por gravedad. Durante estas operaciones, evitar que el conjunto columna-cartucho se quede seco. (Si se forman burbujas de aire en el estrechamiento próximo al cartucho, detener el flujo y golpear la parte superior de la columna de vidrio para eliminar las burbujas. Reanudar de inmediato las operaciones.) Eluir con 25 ml de la mezcla de agua y metanol (15(b).3.5.2). Desechar los eluatos. Eluir la aflatoxina B con 50 ml de la mezcla de agua y acetona (15(b).3.5.3) y recoger la totalidad del eluato en un matraz aforado de 50 ml. Enrasar con agua hasta 50 ml y mezclar, la solución de ensayo obtenida se utiliza para la cromatografía (15(b).4.5).
Atención: Normalmente no es necesario filtrar el extracto final antes de efectuar CLAR. Cuando sea necesario filtrar, deberán evitarse los filtros de celulosa, dado que pueden dar lugar a pérdida de aflatoxina B. Pueden utilizarse filtros de teflón.
15(b).4.5 Cromatografía de líquidos de alta resolución. (Véase la figura 2 para el montaje del equipo.)
Dejar transcurrir el tiempo suficiente para que los instrumentos se calienten y estabilicen antes del uso.
Nota 1: Los caudales que se citan para la fase móvil de CLAR y el reactivo postcolumna son meramente indicativos. Puede ser necesario realizar un ajuste en función de las características de la columna de CLAR.
Nota 2: La respuesta del detector para la aflatoxina B depende de la temperatura, por lo que debe efectuarse la compensación por la deriva (véase la figura 3). La inyección de una cantidad fija del patrón de referencia de la aflatoxina B ((15(b).3.13.3) a intervalos regulares (por ejemplo, cada tres inyecciones) permite corregir, utilizando la respuesta media, los valores de los picos de la aflatoxina B entre estos patrones de referencia, siempre y cuando la diferencia entre las respuestas de patrones de referencia consecutivos sea muy pequeña (R 10 por 100). Por lo tanto, las inyecciones deberán efectuarse sin interrupciones. Si es necesaria una interrupción, la última inyección antes de la interrupción y la primera después de ésta deberán ser inyecciones del patrón de referencia (15(b).3.13.3). Dado que la curva de calibración es lineal y pasa por el origen, las cantidades de aflatoxina B presentes en los extractos de la muestra se determinan directamente por referencia a los patrones adyacentes.
15(b).4.5.1 Ajuste de la bomba CLAR. Ajustar la bomba CLAR (15(b).2.5) de manera que se obtenga un caudal de 0,5 ó 0,3 ml/min para una columna CLAR de 5 xm o 3 xm (15(b).2.6), respectivamente, utilizando la fase móvil (15(b).3.5).
15(b).4.5.2 Ajuste de la bomba para la reacción postcolumna. Ajustar la bomba (15(b).2.7) de manera que se obtenga un caudal de 0,2-0,4 ml/min de solución acuosa saturada de yodo (15(b).3.7). Información a título indicativo: se recomiendan caudales de 0,4 ó 0,2 ml/min, aproximadamente, en asociación con caudales de 0,5-0,3 ml/min de la fase móvil, respectivamente.
15(b).4.5.3 Detector de fluorescencia. Establecer el detector (15(b).2.11) a una longitud de onda de excitación de 365 nm y de emisión de 435 nm (aparato del filtro: T 400 nm). Ajustar el atenuador del detector de manera que el 80 por 100 aproximadamente del recorrido máximo de la plumilla registradora corresponde a 1 ng de aflatoxina B.
15(b).4.5.4 Inyector. Para todas las soluciones inyectar cantidades de 250 xl siguiendo las instrucciones del fabricante del aparato.
15(b).4.5.5 Comprobación de la separación cromatográfica. Inyectar la solución cromatográfica (15(b).3.14.1).
Los valles deberán ser inferiores al 5 por 100 de la suma de las alturas de los picos adyacentes.
15(b).4.5.6 Comprobación de la estabilidad del sistema. Antes de llevar a cabo cada una de las series de análisis, efectuar inyecciones repetidas del patrón de referencia (15(b).3.13.3) hasta que se estabilicen las áreas de los picos.
Nota: Los picos producidos por la aflatoxina B entre inyecciones consecutivas deberán presentar diferencias inferiores al 6 por 100. Proceder inmediatamente a efectuar la comprobación de la linealidad (15(b).4.5.7).
15(b).4.5.7 Comprobación de la linealidad. Inyectar las soluciones de aflatoxina B para calibración (15(b).3.13.1) y (15(b).3.14.4). Utilizar el patrón de referencia (15(b).3.13.3) a intervalos de tres inyecciones, a fin de corregir la deriva en las respuestas.
Nota: Las respuestas de los picos del patrón de referencia deberán presentar diferencias inferiores al 10% en 90 minutos: Corregir la deriva aplicando la fórmula que se indica en el punto 15(b).6. La gráfica de calibración deberá ser lineal y pasar por el origen, dentro de los límites de 2 veces el valor de la desviación típica de la estimación de Y. Los valores hallados deberán diferir en menos del 3% de los valores nominales. Si se cumplen estas condiciones, continuar las operaciones inmediatamente. En caso contrario, identificar y corregir las causas del problema antes de continuar.
15(b).4.5.8 Inyección de extractos de muestra. Inyectar los extractos de muestras purificados (15(b).4.4.2.2). Repetir la inyección del patrón de referencia (15(b).3.13.3) después de dos inyecciones de extracto de muestra de acuerdo a la siguiente secuencia: patrón de referencia, extracto, extracto, patrón de referencia, extracto, extracto, patrón de referencia, etc...
15(b).5 Prueba de confirmación.
15(b).5.1 Tratamiento ulterior del extracto (15(b).4.4.2.2). Añadir 5 ml de la solución de cloruro de sodio (15(b).3.15.1) al extracto final obtenido como se describe en el punto (15(b).4.4.2.2). Extraer tres veces con 2 ml de cloroformo durante 1 minuto, utilizando el embudo de decantación (15(b).2.24.1). Verter los extractos combinados de cloroformo en un tubo de ensayo de 10 ml a través de 1 g aproximadamente de sulfato de sodio (15(b).3.15.2). (Se puede utilizar un embudo pequeño (4 cm de diámetro) colocando en el estrechamiento un algodón recubierto de 1 g de sulfato de sodio aproximadamente).
Lavar la capa de sulfato de sodio con unos ml de cloroformo y recoger los lavados en el mismo tubo de ensayo. Evaporar en dicho tubo el extracto de cloroformo hasta sequedad utilizando la fuente de calor (15(b).2.24.2) y disolverlo de nuevo en 1 ml de cloroformo.
15(b).5.2 Preparación de los derivados y cromatografía en capa fina. Véase la Directiva 76/372/CEE del Consejo, anexo, método A, punto 5.6.2 (método 15(a), punto 15(a).4.4).
15(b).6 Cálculos. Calcular el contenido de aflatoxina B: (xg/kg) de la muestra mediante la fórmula siguiente:
Contenido aflatoxina B en lg/Kg = m · V
Contenido aflatoxina B en lg/Kg = m · V
Contenido aflatoxina B en lg/Kg = m · VV
Contenido aflatoxina B en lg/Kg =V · M · V
Contenido aflatoxina B en lg/Kg = m · VV
Siendo:
m = cantidad, en ng, de aflatoxina B representada por el pico B de la muestra, calculada del siguiente modo:
m = P(muestra) · 2 r (st)
P(st) + P(st)
P (muestra) = área del pico de la aflatoxina B de la muestra.
P (st1) = área del pico de la aflatoxina B del patrón de referencia anterior (15(b).3.13.3).
P (st2) = área del pico de la aflatoxina B del patrón de referencia siguiente (15(b).3.13.3).
r (st) = cantidad inyectada del patrón de referencia (15(b).3.13.3), expresada en ng.
V = volumen del extracto de muestra inyectado, en ml.
V = volumen final del extracto de muestra, en ml (15(b).3.13.3).
M = masa de la muestra en g.
V = volumen del filtrado transferido al cartucho de florisil (15(b).4.4.1.2), en ml.
V = volumen de cloroformo utilizado para la extracción de la muestra, en ml.
Si se aplica el procedimiento expuesto, la fórmula se reduce a:
Contenido de aflatoxina B, en lg/kg = 20 x m.
15(b).6.1 El cálculo de los resultados también puede efectuarse midiendo la altura de los picos.
15(b).7 Repetibilidad. Véase el punto 15(b).9.1 (observaciones).
15(b).8 Reproducibilidad. Véase el punto 15(b).9.1.
15(b).9 Observaciones.
15(b).9.1 Precisión.
En el cuadro 1 figuran los resultados de la repetibilidad y reproducibilidad obtenidos en un ensayo colaborativo (1) sobre piensos compuestos realizado a escala internacional. El término repetibilidad (r) utilizado aquí se define como la mayor diferencia no significativa, con una probabilidad del 95 por 100, entre dos lecturas de una misma muestra efectuadas en el mismo laboratorio y en condiciones similares. El término reproducibilidad (R) se define de manera análoga y se refiere a la comparación entre los resultados obtenidos en dos laboratorios diferentes. Con arreglo a la norma ISO 3534-1977, 2.35 (2) y a la Decisión 89/610/CEE de la Comisión (3), tanto r como R también figuran en el cuadro 1 en forma de coeficientes de variación.
CUADRO 1
Repetibilidad (r) y reproducibilidad (R) expresadas
en diferencias y en coeficientes de variación
15. Laboratorios
Nivel (lg/kg) / r / R / CVt(*) Porcentaje / CVr Porcentaje
8-14 / 1,4 / 1,7 / 11 / 18
(*) CV = Coeficiente de variación.
(1) Egmond, H.P. van. Heisterkamp, S.H. and Paulsch, W.E. (1991), Food Additives and Contaminants 8, 17-29.
(2) ISO 3534-1977.
(3) DO n.º L 351 de 2.12.1989, p 39.
15(b).9.2 Estabilidad del cloroformo (15(b).3.13.3). Las características de absorción del cartucho de florisil pueden verse modificadas si se utiliza un estabilizador diferente del etanol. Esto debe ser verificado con arreglo al punto 15(b).9.3 cuando no se disponga del cloroformo descrito.
15(b).9.3 Exactitud. La aplicación correcta del método deberá comprobarse efectuando mediciones repetidas con materiales de referencia certificados. Si no se dispone de estos materiales, la validez del método deberá comprobarse mediante experimentos de recuperación en muestras en blanco. La diferencia entre la media y el valor real no deberá rebasar los límites de -20 a 10 por 100 del valor real.
15(b).10 Referencias. Directiva 92/95/CEE. «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 327, de 9 de noviembre de 1992.
(FIGURAS OMITIDAS)
16. Indice de peróxidos
Esta determinación será aplicable a aquellas grasas que se utilicen como materia prima.
El procedimiento será el que figura en el método número 21 de los métodos oficiales de análisis de Aceites y Grasas aprobados por Orden de 31 de enero de 1977 («Boletín Oficial del Estado» de 14 de julio).
En el caso de que fuera necesario preparar la muestra, se seguirá el procedimiento recogido en el método número 1 de la mencionada Orden.
17. Fósforo total
(Método espectrofotométrico)
17.1 Principio. Determinación del fósforo de una muestra mineralizada, mediante la transformación de sus compuestos fosforados en ortofosforados.
La mineralización se realiza por vía seca (calcinación) y posterior disolución en ácido, o bien por digestión ácida.
Medida de la absorbancia a 430 nm del complejo formado con el reactivo nitro-molibdo-vanadato.
17.2 Material y aparatos.
17.2.1 Espectrofotómetro, capaz de efectuar lecturas de 430 nm, con cubetas de 10 mm de paso de luz.
17.2.2 Crisoles de incineración de cuarzo o porcelana.
17.2.3 Tubos de ensayo de 25 a 30 ml con boca de vidrio esmerilado.
17.2.4 Pipetas de doble enrase de 5, 10, 15, 20, 25 y 50 ml.
17.2.5 Matraces Kjeldahl de 250 a 500 ml de capacidad.
17.2.6 Matraces aforados de 100, 250, 500 y 1000 ml.
17.3 Reactivos.
17.3.1 Carbonato de calcio.
17.3.2 Acido clorhídrico de d = 1,19 g/ml.
17.3.3 Acido nítrico de d = 1,38 - 1,42 g/ml.
17.3.4 Acido nítrico de d = 1,045 g/ml (10 por 100 m/v).
17.3.5 Acido sulfúrico de d = 1,84 g/ml.
17.3.6 Amoníaco concentrado de d = 0,910 g/ml.
17.3.7 Solución de heptamolibdato amónico. Disolver en agua caliente 100 g de heptamolibdato de amonio, tetrahidrato (NH)MoO · 4HO. Se añaden 10 ml de amoníaco (17.3.6), se trasvasa a matraz aforado de 1000 ml, y una vez frío se completa con agua hasta el enrase.
17.3.8 Solución de metavanadato amónico. Disolver 2,35 g de metavanadato de amonio (NHVO) en un erlenmeyer de 500 ml con 400 ml de agua destilada caliente. Añadir lentamente y agitando 20 ml de una solución que contiene 7 ml de ácido nítrico (17.3.3) y 13 ml de agua destilada. Llevar a matraz aforado de 1000 ml y, una vez frío, enrasar con agua destilada.
17.3.9 Solución de nitro-molibdo-vanadato. En matraz de litro aforado, mezclar 200 ml de solución de heptamolibdato de amonio (17.3.7) con 200 ml de solución de metavanadato de amonio (17.3.8) y 134 ml de ácido nítrico (17.3.3). Completar con agua destilada hasta el enrase.
17.3.10 Solución patrón de fósforo conteniendo 1 mg de fósforo por mililitro. Disolver en matraz aforado de litro 4,387 g de fosfato monopotásico (KHPO) (previamente desecado en estufa de 100º C hasta peso constante) en agua destilada y llevar a enrasar.
17.4 Procedimiento.
17.4.1 Curva de calibrado.
En matraz aforado de 100 ml y a partir de la solución patrón de fósforo (17.3.10) preparar soluciones conteniendo 0, 5, 10, 20, 30 y 40 microgramos de fósforo por mililitro.
En seis erlenmeyer o tubos de ensayo (17.2.3) tomar con pipetas de doble enrase 10 ml de cada solución patrón de fósforo. Añadir a cada uno de ellos, tambien con pipeta de doble enrase, 10 ml del reactivo de nitro-molibdovanadato (17.3.9), agitar para homogeneizar y dejar en reposo diez minutos a 20º C.
Efectuar las lecturas fotométricas a 430 nm, empleando cubetas de 10 mm de paso de luz, utilizando la solución blanco de fósforo como solución de referencia.
Representar gráficamente las absorbancias obtenidas frente a los microgramos/mililitros o a los miligramos de fósforo existentes en cada lectura.
17.4.2 Preparación de la muestra.
17.4.2.1 Mineralización por calcinación (para muestras que contienen sustancias orgánicas libres de fosfatos que den productos insolubles al incinerar).
Pesar 2,5 g de la muestra, con precisión de 1 mg, en cápsulas de cuarzo o porcelana.
Mezclar con 1 g de carbonato de calcio (17.3.1.). Poner en mufla a 550 ºC - 5 ºC hasta la obtención de cenizas blancas o grises (una pequeña parte de carbón no interfiere). Transferir las cenizas a un vaso de 150 ml. Añadir 10 ml de agua lavando el crisol con ácido clorhídrico (17.3.2) hasta que cese la efervescencia. Añadir otros 10 ml de ácido clorhídrico (17.3.2). Evaporar el ácido clorhídrico en baño de arena a ebullición hasta sequedad. Enfriar y disolver el residuo con 10 ml de ácido nítrico (17.3.4), hervir en baño de arena durante cinco minutos, sin llegar a sequedad. Filtrar a través de papel sobre matraz aforado de 500 ml, lavar con agua destilada el vaso y enrasar una vez frío.
17.4.2.2 Mineralización por digestión ácida (para compuestos minerales y piensos líquidos). Pesar 1 g de muestra, con precisión de 1 mg, y llevar a matraz Kjeldahl (17.2.5), añadir 20 ml de ácido sulfúrico (17.3.5), agitar el matraz circularmente para evitar que la muestra se adhiera a las paredes y hervir durante diez minutos. Dejar enfriar un poco y añadir 2 ml de ácido nítrico (17.3.3), calentar y llevar otra vez al punto de ebullición. Repetir este procedimiento hasta decoloración de la solución. Enfriar, añadir un poco de agua y trasvasar el líquido, filtrando si es necesario, a matraz aforado de 500 ml, lavar el matraz Kjeldahl con agua caliente, y unir los líquidos del lavado si es preciso a través del filtro empleado inicialmente. Una vez frío, añadir agua hasta el enrase.
17.4.3 Desarrollo del color y medida de la absorbancia. Diluir una alícuota del filtrado problema, para conseguir una concentración de fósforo no superior a 40 microgramos/ml.
Transferir 10 ml de esta solución a erlenmeyer o tubo de ensayo (17.2.3) y añadir 10 ml del reactivo nitro-molibdovanadato (17.3.9). Las dos soluciones tomadas con pipeta de dos enrases. Mezclar bien y dejar diez minutos en reposo. Transferir una alícuota a la célula y medir la absorbancia en el espectrofotómetro a 430 nm, usando como referencia una solución de 10 ml de solución blanco con 10 ml del reactivo nitro-molibdo-vanadato.
Efectuar siempre un ensayo en blanco con los reactivos utilizados, siguiendo el mismo procedimiento exprerimental. Usar éste como referencia en cada lectura espectrofotométrica.
17.5 Cálculos. Determinar la concentración de fósforo en la porción alícuota diluida de la solución problema o de los microgramos/mililitros de dicha solución, por referencia a la curva de calibrado, calculando el porcentaje en peso de fósforo en la muestra.
% P = S · C · C · ... C
G · 10.000 · A · A · ... A
Siendo:
G = Peso de la muestra en gramos.
C C ... C = Diluciones a que se llevaron las alícuotas en mililitros.
A A ... A = Alícuotas tomadas para las diluciones sucesivas en mililitros.
S = Microgramos/mililitros de fósforo medidos de la solución problema con relación a la curva de calibrado.
17.6 Observaciones. La diferencia entre el resultado de dos determinaciones sucesivas no debe exceder de:
3 por 100 (valor relativo), con contenidos de fósforo menor del 5 por 100 (m/m).
0,1 por 100 (valor absoluto) para contenidos de fósforo igual o mayor que el 5 por 100 (m/m).
17.7 Referencias. Segunda Directiva de la Comisión de 18 de noviembre de 1971 (71/383/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 279, de 20 de diciembre.
18. Proteína bruta soluble en ácido clorhídrico
y pepsina
18.1 Principio. El método permite determinar la fracción de las proteínas brutas solubilizadas por la pepsina y el ácido clorhídrico en las condiciones dadas. Es aplicable a las harinas de origen animal.
La muestra se somete a digestión durante cuarenta y ocho horas a 40 ºC por una solución clorhídrica de pepsina. La suspensión se filtra o centrifuga y se determina el contenido en nitrógeno del filtrado o del sobrenadante, según el método oficial número 3.
18.2 Material y aparatos.
18.2.1 Baño de agua o estufa de incubación regulada a 40 ºC ± 1 ºC.
18.2.2 Mineralizador y destilador Kjeldahl.
18.3 Reactivos.
18.3.1 Acido clorhídrico (d = 1,125).
18.3.2 Solución de ácido clorhídrico 0,075N.
18.3.3 Pepsina 2,0 U/mg. La actividad debe controlarse según el método oficial número 19.
18.3.4 Solución preparada recientemente de pepsina 0,02 por 100 (p/v) en la solución de ácido clorhídrico (18.3.2). Actividad 400 U/l.
18.3.5 Antiespumante.
18.3.6 Los que figuran en 3.3.
18.4 Procedimiento. Pesar, con precisión de 1 mg, 2 g de muestra. Introducir la muestra en matraz aforado de 500 ml y añadir 450 ml de solución clorhídrica de pepsina (18.3.4), previamente llevada a 40 ºC. Agitar de forma que se evite la formación de aglomerados. Comprobar que el pH de la suspensión sea inferior a 1,7. Llevar el matraz al baño de agua o a la estufa de incubación (18.2.1) y mantenerlo durante cuarenta y ocho horas a 40 ºC ± 1 ºC, agitar a las ocho, veinticuatro y treinta y dos horas. Después de 48 horas añadir 15 ml de ácido clorhídrico (18.3.1), refrigerar hasta 20 ºC, enrasar el matraz con agua y filtrar.
Tomar 250 ml del filtrado e introducirlos en la matraz de digestión Kjeldahl y proceder como en el método oficial número 3. Efectuar una prueba en blanco.
18.5 Cálculos. El contenido en proteína soluble en clorhídrico y pepsina para 100 g de muestra vendrá dado por la siguiente fórmula:
Proteína soluble/100 g muestra = 2 · 1,4 · 6,25 (VN V'N')
P
Siendo:
P = Peso, en g, de la muestra.
V = Volumen, en ml, de ácido sulfúrico.
N = Normalidad del ácido sulfúrico.
V'= Volumen, en ml, de hidróxido de sodio consumidos en la valoración.
N' = Normalidad de la solución de hidróxido de sodio.
18.6 Observaciones. Los productos cuyo contenido en materias grasas exceda del 10 por 100 deben ser previamente desengrasados por extracción con éter de petróleo.
18.7 Referencias. Tercera Directiva de la Comisión de 27 de abril de 1972 (72/199/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L, 123 de 29 de mayo.
19. Actividad de la pepsina
19.1 Principio. El método sirve para comprobar la actividad de la pepsina utilizada en la determinación de la proteína soluble en pepsina y ácido clorhídrico.
La hemoglobina se trata en las condiciones definidas con pepsina y ácido clorhídrico. La fracción no hidrolizada de las proteínas se precipita por el ácido tricloroacético. Al filtrado se la añade solución de hidróxido de sodio y reactivo de Folin-Ciocalteu. La absorbancia de esta solución se mide a 750 nm y la cantidad de tirosina correspondiente se lee sobre una curva patrón.
La unidad de pepsina se define como la cantidad de dicha enzima que libera por minuto, en las condiciones del método, una cantidad de compuestos hidroxiarilos cuya coloración por el reactivo de Folin-Ciocalteu tiene una absorbancia correspondiente a la de un mol de tirosina, en las mismas condiciones.
19.2 Material y aparatos.
19.2.1 Baño de agua, regulado a 25 ºC ± 0,1 ºC por el ultratermostato.
19.2.2 Espectrofotómetro.
19.2.3 Cronómetro; precisión: 1 segundo.
19.2.4 pH-metro.
19.3 Reactivos.
19.3.1 Acido clorhídrico 0,2N.
19.3.2 Acido clorhídrico 0,26N.
19.3.3 Acido clorhídrico 0,025N.
19.3.4 Solución al 5 por 100 (p/v) de ácido tricloroacético.
19.3.5 Solución de hidróxido de sodio 0,5N.
19.3.6 Reactivo de Folin-Ciocalteu. Introducir 100 g de wolframato de sodio dihidrato (NaWO · 2HO), 25 g de molibdato de sodio dihidrato (NaMO · 2HO) y 700 ml de agua en un matraz de fondo redondo de 2 litros de cierre esmerilado. Añadir 50 ml de ácido fosfórico (d = 1,71) y 100 ml de ácido clorhídrico concentrado (d = 1,19), ajustar al matraz un refrigerante de reflujo, calentar hasta ebullición y mantener la solución en ebullición suave durante 10 h. Dejar refrigerar, separar el refrigerante de reflujo, añadir 175 g de sulfato de litio dihidrato (LiSO · 2HO), 50 ml de agua y 1 ml de bromo. Hacer hervir durante 15 minutos para eliminar el exceso de bromo.
Dejar refrigerar, trasvasar la solución en un matraz aforado de 1 litro, completar el volumen con agua, homogeneizar y filtrar. El reactivo obtenido no debe presentar coloración verduzca. Antes de su empleo, diluir 1 volumen del reactivo con dos volúmenes de agua.
19.3.7 Solución de hemoglobina: Pesar una cantidad de hemoglobina, sustrato proteico según Anson (2 g aproximadamente) correspondiente a 354 mg de nitrógeno e introducir en un matraz de 200 ml de cierre esmerilado. Determinar el contenido en nitrógeno mediante un semi-microkjeldahl (contenido teórico: 17,7 por 100 de nitrógeno). Añadir algunos ml de ácido clorhídrico (19.3.2) conectar el matraz a la bomba de vacío y agitar hasta disolución completa de hemoglobina. Dejar de hacer el vacío y añadir, agitando constantemente, ácido clorhídrico (19.3.2) para completar a 100 ml. Preparar inmediatamente antes de su empleo.
19.3.8 Solución patrón de tirosina: Disolver 181,2 mg de tirosina en ácido clorhídrico (19.3.2) y completar a 1 litro con el mismo ácido clorhídrico.
19.3.9 Solución patrón de trabajo: Tomar 20,0 ml de la solución (19.3.8) y diluir a 100 ml con ácido clorhídrico (19.3.1). Un ml de dicha solución contiene 0,2 micromoles de tirosina.
19.4 Procedimiento.
19.4.1 Preparación de la solución (ver 19.6.1). Disolver 150 mg de pepsina en 100 ml de ácido clorhídrico (19.3.2). Tomar mediante pipeta 2 ml de la solución, introducirlos en un matraz aforado de 50 ml y completar a volumen mediante ácido clorhídrico (19.3.3). El pH, controlado por el pH-metro, debe ser de 1,6 ± 0,1. Mantener el matraz en baño de agua a 25 ºC (19.2.1).
19.4.2 Hidrólisis. Introducir mediante pipeta en tubo de ensayo 5,0 ml de solución de hemoglobina (19.3.7) llevar a 25 ºC en el baño de agua (19.2.1) añadir 1,0 ml de la solución de pepsina obtenida en (19.4.1) y mezclar, con ayuda de una varilla de cristal ensanchada en un extremo, mediante aproximadamente 10 movimientos de vaivén. Mantener el tubo de ensayo en el baño de agua a 25 ºC durante diez minutos exactamente, contados desde el momento de la adición de la solución de pepsina (la duración y la temperatura deben ser perfectamente respetadas). Añadir a continuación 10,0 ml de solución de ácido tricloroacético (19.3.4) previamente llevada a 25 ºC. Homogeneizar y filtrar sobre un filtro seco.
19.4.3 Desarrollo de la coloración y medición de la absorbancia. Tomar mediante pipeta 5,0 ml del filtrado, introducirlos en un erlenmeyer de 50 ml, añadir 10,0 ml de solución de hidróxido de sodio (19.3.5) y agitando continuamente, 3,0 ml de reactivo diluido de Folin-Ciocalteu (19.3.6). Después de cinco a diez minutos, determinar la absorbancia de la solución a 750 nm en cubetas de 1 cm de espesor, usando como blanco agua.
19.4.4 Prueba en blanco. Para cada determinación, proceder a una prueba en blanco tal como se indica a continuación. Introducir mediante pipeta en un tubo de ensayo 5,0 ml de solución de hemoglobina (19.3.7), llevar a 25 ºC en el baño de agua (19.2.1.), añadir 10,0 ml de solución de ácido tricloroacético (19.3.4) previamente llevado a 25 ºC, homogeneizar y añadir a continuación 1,0 ml de la solución de pepsina obtenida en 19.4.1. Mezclar con la ayuda de una varilla de cristal y mantener el tubo de ensayo diez minutos exactamente en el baño de agua (19.2.1.) a 25 ºC. Homogeneizar y filtrar sobre un filtro seco.
Continuar el método operativo tal como se indica en 19.4.3.
19.4.5 Curva de calibrado. Introducir en erlenmeyers de 50 ml volúmenes de 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 ml de solución patrón de tirosina (19.3.9) correspondientes respectivamente a unas cantidades de tirosina de 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; y 1,0 micromoles. Completar la serie mediante un testigo exento de tirosina. Llevar los volúmenes a 5,0 ml con la ayuda del ácido clorhídrico (19.3.1). Añadir 10,0 ml de solución de hidróxido de sodio (19.3.5). y agitando constantemente, 3,0 ml del reactivo diluido de Folin-Ciocalteu (19.3.6). Medir la absorbancia tal como se indica en la última frase del punto (19.4.3). Trazar la curva de calibrado situando las concentraciones de tirosina frente a las absorbancias obtenidas.
19.5 Cálculos. Leer sobre la curva de calibrado la cantidad de tirosina, en micromoles correspondiente a la absorbancia de la solución coloreada, corregida de la prueba en blanco.
La actividad de la pepsina, en micromoles de tirosina, por mg y por minuto a 25 ºC, viene dada por la fórmula siguiente:
Unidades por mg (U/mg) = 0,32 · a
P
Siendo:
a = Cantidad de tirosina en micromoles leída sobre la curva patrón.
P = Peso en mg de la cantidad de pepsina añadida en 19.4.2.
19.6 Observaciones.
19.6.1 La cantidad de pepsina que haya que ponerse en la solución debe ser tal que pueda obtener una absorbancia final de 0,35 ± 0,035.
19.6.2 Dos unidades por mg obtenidas por el presente método corresponden a 3,64 unidades millonésimas Anson/mg (micromoles de tirosina/mg por minuto a 35,5 ºC), o 36.400 unidades comerciales/g, (micromol de tirosina/g en 10 minutos a 35,5 ºC).
19.7 Referencias. Tercera Directiva de la Comisión de 27 de abril de 1972 (72/199/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L, 123 de 29 de mayo.
20. Caseína total
20.1 Principio. Se basa en precipitar (después de reconstituida la leche en agua tibia), la caseína a su punto isoeléctrico. Por lavado se recoge la caseína pura eliminando el suero y las impurezas. Se determina via Kjeldahl su nivel de proteína N x 6,38 y este valor deducido el blanco correspondiente se expresa en caseína.
Este método es aplicable a materias primas lácteas (leche en polvo descremada, entera o semidescremada).
20.2 Material y aparatos.
20.2.1 Material necesario para determinación de proteína bruta.
20.2.2 Baño de agua con termostato para 40 ºC.
20.2.3 Centrífuga capaz de alcanzar 4.000 r.p.m.
20.3 Reactivos.
20.3.1 Reactivos necesarios para determinación de proteína bruta.
20.3.2 Acido acético. Dilución al 10 por 100 (p/v).
20.3.3 Dilución de acetato de sodio 1N.
20.3.4 Papel de filtro Albet número 240 o similar.
20.4 Procedimiento. Pesar 5 g de muestra, con precisión de 1 mg. Disolver en 100 ml de agua desionizada calentada a 40-45 ºC. Centrifugar a 4.000 r.p.m. durante 15 minutos. Tomar 20 ml de la solución y calentar en baño de agua a 40 ºC durante cinco o diez minutos. Añadir 5 ml de ácido acético (20.3.2) y dejar que precipite durante 10 minutos.
Añadir 5 ml de solución de acetato de sodio (20.3.3) y esperar 10 minutos a que el precipitado de caseína evolucione y se aglomere. Filtrar sobre papel de filtro (20.3.4).
Lavar con agua acidulada con unas gotas de ácido acético para eliminar el resto de proteínas solubles lácteas o no, hasta conseguir una cuajada de caseína pura.
A continuación determinar el contenido en nitrógeno del precipitado, según el método Kjeldahl (método oficial número 3).
20.5 Cálculo. El contenido en caseína se dará en procentaje de peso según:
Caseína % = N x 6,38
Siendo:
N = Nitrógeno total del precipitado expresado en porcentaje de muestra.
20.6 Observaciones. El lavado de la cuajada debe hacerse con agua acidulada y con gran cuidado, de un lado para que no resten en ella proteínas séricas, de otro para que no pierda caseína por manipulación indebida.
20.7 Referencias. Métodos Oficiales de Análisis de Leches. Método número 3.
21. Urea
21.1 Principio. Defecación de la muestra y medida de la absorbancia a 420 nm del compuesto formado al añadir p-dimetilaminobenzaldehido.
21.2 Material y aparatos.
21.2.1 Mezclador o agitador capaz de efectuar de 35 a 40 vueltas por minuto.
21.2.2 Tubos de ensayo de aproximadamente 160 x 16 mm con tapones de rosca.
21.2.3 Espectrofotómetro.
21.3 Reactivos.
21.3.1 Solución de p-dimetilaminobenzaldehido (D.M.A.B.).
Disolver 1,6 g de (D.M.A.B.) en 100 ml de etanol del 96 por 100 y añadir 10 ml de ácido clorhídrico (d = 1,19 g/ml). Este reactivo se conserva hasta un máximo de dos semanas.
21.3.2 Solución Carrez I.
Disolver 24 g de acetato de zinc trihidrato (Zn(CH - COO) · 3HO) y 3 ml de ácido acético glacial en agua destilada y completar hasta 100 ml.
21.3.3 Solución Carrez II.
Disolver 10,6 g de hexacianoferrato (II) de potasio trihidrato (KFe(CN) · 3HO) en agua destilada y completar hasta 100 ml.
21.3.4 Carbón activo que no absorba urea.
21.3.5 Solución patrón de urea al 0,1 por 100 (p/v).
21.4 Procedimiento.
21.4.1 Curva de calibrado. Llevar volúmenes de 1, 2, 4, 5, y 10 ml de la solución patrón de urea (21.3.5) a matraces aforados de 100 ml y enrasar con agua destilada. Tomar 5 ml de cada solución, llevar a los tubos (21.2.2) y añadir respectivamente 5 ml de la solución DMAB (21.3.1). Mezclar y poner los tubos en baño de agua a 20 ºC durante 15 minutos. Medir la absorbancia de cada solución a 420 nm frente a un blanco obtenido al tomar 5 ml de agua destilada y siguiendo el mismo procedimiento. Obtener la curva de calibrado.
21.4.2 Preparación de la muestra. Pesar con aproximación de 1 mg, 2 g de muestra e introducirlos en un matraz aforado de 500 ml y añadir 1 g de carbón activo (21.3.4). Añadir 400 ml de agua destilada, 5 ml de solución Carrez I y 5 ml de solución Carrez II. Poner el matraz en el agitador (21.2.1) durante 30 minutos. Enrasar con agua destilada, agitar y filtrar.
21.4.3 Determinación. Tomar 5 ml del filtrado y llevar a los tubos (21.2.2). Añadir 5 ml de la solución DMAB (21.3.1) y continuar como en (21.4.1).
21.5 Cálculos. Determinar el contenido de urea al comparar las absorbancias obtenidas de la muestra frente a las de la curva de calibrado. Expresar el resultado en porcentaje de muestra.
21.6 Referencias. Primera Directiva de la Comisión de 15 de junio de 1971 (71/250/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 155, de 12 de julio de 1973.
22. Acido cianhídrico
22.1 Principio. La muestra se suspende en agua. El ácido cianhídrico se libera bajo la acción de fermentos, se arrastra por destilación en vapor de agua y se recoge en un volumen determinado de solución de nitrato de plata acidificada. El cianuro de plata se separa por filtración y el exceso de nitrato de plata se valora mediante una solución de tiocianato de amonio.
El método permite determinar el contenido en ácido cianhídrico libre y combinado en forma de glucósidos existentes en determinados piensos y, en particular, de los productos de semillas de lino, de harina de mandioca y de determinadas especies de leguminosas.
22.2 Material y aparatos.
22.2.1 Estufa provista de un termostato regulado a 38 ºC.
22.2.2 Aparato de destilación en corriente de vapor de agua provisto de un refrigerante con alargadera curvada.
22.2.3 Matraces de fondo plano de 100 ml de tapón esmerilado.
22.2.4 Baño de aceite.
22.2.5 Bureta graduada a 1/20 ml.
22.3 Reactivos.
22.3.1 Suspensión de almendras dulces:
Triturar 20 almendras dulces peladas en 100 ml de agua a una temperatura de 37 a 40 ºC. Comprobar la ausencia de ácido cianhídrico sobre 10 ml de la suspensión, con ayuda de un papel picro-sódico o efectuando una prueba en blanco como se indica en el último apartado de 22.4.
22.3.2 Solución al 10 por 100 (p/v) de acetato de sodio, neutro a la fenolftaleína.
22.3.3 Emulsión de antiespuma (silicona, por ejemplo).
22.3.4 Acido nítrico, d = 1,40.
22.3.5 Solución de nitrato de plata 0,02N.
22.3.6 Solución de tiocianato de amonio 0,02N.
22.3.7 Solución saturada de sulfato férrico amónico.
22.3.8 Amoníaco d = 0,958.
22.4 Procedimiento. Pesar, con precisión de 5 mg, 20 g de la muestra, introducirlos en un matraz de 1 litro de fondo plano y añadir 50 ml de agua y 10 ml de suspensión de almendras dulces (22.3.1). Tapar el matraz y mantenerlo durante dieciséis horas en la estufa a 38 ºC. Enfriar a continuación a la temperatura ambiente y añadir 8 ml de agua y 10 ml de solución de acetato de sodio (22.3.2) y una gota de emulsión antiespuma (22.3.3).
Conectar el matraz al aparato de destilación al vapor y situarlo en un baño de aceite previamente llevado a una temperatura ligeramente superior a 100 ºC. Destilar de 200 a 300 ml de líquido haciendo pasar en el matraz una fuerte corriente de vapor y calentando suavemente el baño de aceite. Recoger el destilado en un erlenmeyer situado al resguardo de la luz y que contenga 50 ml exactamente de solución de nitrato de plata 0,02N (22.3.5) y 1 ml de ácido nítrico (22.3.4). Asegurarse para que la alargadera del refrigerante quede sumergida en la solución de nitrato de plata.
Trasvasar el contenido del erlenmeyer a un matraz aforado de 500 ml, completar el volumen con agua, agitar y filtrar. Tomar 250 ml del filtrado, añadir 1 ml aproximadamente de solución de sulfato férrico amónico (22.3.7) y valorar en retroceso el exceso de nitrato de plata por la solución de tiocianato de amonio 0,02N (22.3.6.) suministrada por la bureta graduada a 1/20 ml.
Efectuar en el caso en que fuera necesario un ensayo en blanco aplicando el mismo método operatorio a 10 ml de suspensión de almendras dulces (22.3.1), en ausencia de la muestra para analizar.
22.5 Cálculos. Si la prueba en blanco indica un consumo de la solución de nitrato de plata 0,02N, sustraer este valor del volumen consumido por el destilado de la muestra.
1 ml de nitrato de plata 0,02N corresponde a 0,54 de ácido cianhídrico. Expresar el resultado en porcentaje de la muestra.
22.6 Observaciones. Si la muestra contiene una cantidad importante de sulfuros (judías, por ej.), se forma un precipitado negro de sulfuro de plata que se filtra con el sedimento de cianuro de plata. La formación de este precipitado entraña una pérdida de solución de nitrato de plata 0,02N cuyo volumen debe sustraerse del volumen tomado en consideración para el cálculo del contenido en ácido cianhídrico. Con tal fin, proceder como se indica a continuación:
Tratar el sedimento sobre el filtro con 50 ml de amoníaco (22.3.8) para disolver el cianuro de plata. Lavar el residuo mediante amoníaco diluido y proceder a la determinación de su contenido en plata. Convertir el valor obtenido en ml de solución de nitrato de plata 0,02N.
El contenido en ácido cianhídrico de la muestra puede determinarse igualmente mediante titulación del filtrado amoniacal acidificado por el ácido nítrico.
22.7 Referencias. Primera Directiva de la Comisión de 15 de junio de 1971 (71/250/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 155, de 12 de julio.
23. Determinación de las cenizas insolubles
en ácido clorhídrico
23.1 Principio. El método permite determinar el contenido en materias minerales insolubles en ácido clorhídrico de los piensos y sus materias primas. Se prevén dos procedimientos en función de la naturaleza de la muestra.
23.1.1 Procedimiento A. Aplicable a las materias primas orgánicas y a la mayor parte de los piensos compuestos.
23.1.2 Procedimiento B. Aplicable a mezclas minerales, así como a los piensos compuestos cuyo contenido en insoluble clorhídrico, determinado según el Procedimiento A, sea superior a 1 por 100.
23.1.3 Procedimiento A. Se incinera la muestra, se tratan las cenizas por ebullición en ácido clorhídrico y el residuo insoluble se filtra y se pesa.
23.1.4 Procedimiento B. La mezcla se trata mediante ácido clorhídrico. La solución se filtra, el residuo se incinera y las cenizas obtenidas se tratan como el Procedimiento A.
23.2 Material y aparatos.
23.2.1 Placa calefactora.
23.2.2 Horno eléctrico, con termostato.
23.2.3 Crisoles de incineración de platino o de aleación de platino y oro (10 por 100 Pt, 90 por 100 Au), rectangulares (60 x 40 x 25 mm) o redondos (diámetro: 60 a 75 mm, altura 20 a 25 mm) o crisoles de otro material capaces de soportar una temperatura de 700 ºC.
23.3 Reactivos.
23.3.1 Acido clorhídrico 3N.
23.3.2 Solución al 20 por 100 (p/v) de ácido tricloroacético.
23.3.3 Solución al 1 por 100 (p/v) de ácido tricloroacético.
23.4 Procedimiento.
23.4.1 Procedimiento A. Incinerar la muestra según el método oficial descrito para la determinación de las cenizas brutas. Se podrán emplear igualmente las cenizas obtenidas al efectuar dicha determinación. Traspasar las cenizas a un vaso de 250 a 400 ml con 75 ml de ácido clorhídrico 3N (23.3.1). Llevar el líquido cuidadosamente a ebullición suave y mantener ésta durante quince minutos. Filtrar la solución caliente sobre un papel de filtro sin cenizas y lavar el residuo con agua caliente hasta la desaparición de reacción ácida. Secar el filtro que contiene el residuo e incinerar en un crisol tarado a una temperatura de 550 ºC como mínimo y de 700 ºC como máximo. Refrigerar en desecador y pesar.
23.4.2 Procedimiento B. Pesar, con precisión de 1 mg, 5 g de la muestra e introducirlos en un vaso de 250 a 400 ml. Añadir sucesivamente 25 ml de agua y 25 ml de ácido clorhídrico 3N (23.3.1), mezclar y esperar al final de la efervescencia.
Añadir 50 ml de ácido clorhídrico 3N (23.3.1). Si hay un nuevo desprendimiento de gases, esperar a su final y colocar a continuación el vaso en un baño de agua hirviendo y mantenerlo allí durante treinta minutos o más, si fuera necesario, con el fin de hidrolizar completamente el almidón que pueda estar presente. Filtrar en caliente sobre filtro sin cenizas y lavar el filtro mediante 50 ml de agua caliente (23.7), colocar el filtro que contiene el residuo en un crisol de incineración, secar e incinerar a una temperatura de 550 ºC como mínimo y 700 ºC como máximo. Continuar tal como se indica en 23.4.1, párrafo segundo.
23.5 Cálculos. Calcular el peso del residuo deduciendo el peso del crisol vacío. Expresar el resultado en porcentaje de la muestra.
23.6 Observaciones. Si la filtración se mostrara difícil, volver a comenzar la determinación sustituyendo los 50 ml de ácido clorhídrico 3N por 50 ml de ácido tricloroacético al 20 por 100 (23.3.2) y lavando el filtro con ayuda de una solución caliente de ácido tricloroacético al 1 por 100 (23.3.3).
23.7 Referencias. Primera Directiva de la Comisión de 15 de junio de 1971 (71/250/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 155, de 12 de julio de 1971.
24. Esencia de mostaza
24.1 Principio. La muestra se pone en suspensión en agua. Las esencias de mostaza se liberan bajo la acción de fermentos, se arrastran por destilación en presencia de etanol y se recogen en el amoníaco diluido. La solución se trata en caliente con un volumen determinado de solución de nitrato de plata, refrigerado y filtrado. El exceso de nitrato de plata se titula mediante una solución de tiocianato de amonio.
El método permite determinar el contenido en esencia de mostaza arrastrable por el vapor de agua, expresado en isotiocianato de alilo, de la torta de las especies Brassica y Sinapis y de los piensos compuestos que la contienen.
24.2 Material y aparatos.
24.2.1 Matraces de 500 ml de fondo plano y tapón esmerilado.
24.2.2 Aparato de destilar provisto de un refrigerante y de un dispositivo que permita evitar el arrastre de líquido.
24.3 Reactivos.
24.3.1 Mostaza blanca (Sinapis alba).
24.3.2 Etanol, del 95 al 96 por 100 (v/v).
24.3.3 Emulsión de antiespuma (silicona, por ejemplo).
24.3.4 Amoníaco, d = 0,958.
24.3.5 Solución de nitrato de plata 0,1N.
24.3.6 Solución de tiocianato de amonio 0,1N.
24.3.7 Acido nítrico, d = 1,40.
24.3.8 Solución saturada de sulfato férrico amónico.
24.4 Procedimiento. Pesar, con precisión de 1 mg, 10 g de la muestra, introducirlos en un matraz de 500 ml de fondo plano y añadir 2 g de mostaza blanca triturada finalmente (fuente de fermento) (24.3.1) y 200 ml de agua a 20 ºC. Tapar el matraz y mantenerlo durante dos horas aproximadamente a 20 ºC agitándolo frecuentemente. Añadir a continuación 40 ml de etanol (24.3.2) y una gota de emulsión antiespuma (24.3.3). Destilar 150 ml aproximadamente y recoger el destilado en un matraz aforado de 250 ml que contenga 20 ml de amoníaco (24.3.4) prestando atención para que la extremidad del refrigerante se sumerja en el líquido. Añadir a la solución amoniacal 50 ml de solución de nitrato de plata 0,1N (24.3.5) (o más si fuera necesario), colocar sobre el matraz aforado un pequeño embudo y calentar la mezcla durante una hora en un baño de agua hirviendo. Dejar enfriar, completar el volumen con agua, agitar y filtrar. Tomar 100 ml del filtrado límpido, añadir 5 ml de ácido nítrico (24.3.7) y 5 ml aproximadamente de solución de sulfato férrico amónico (24.3.8). Valorar por retroceso el exceso de nitrato de plata con la solución de tiocianato de amonio 0,1N (24.3.6).
Efectuar una prueba en blanco aplicando el mismo método a 2 g de mostaza blanca triturada finalmente.
24.5 Cálculos. Restar el volumen de solución de nitrato de plata 0,1N consumido en la prueba en blanco del consumido por la solución de la muestra. El valor obtenido da el número de ml de solución de nitrato de plata 0,1N consumidos por la esencia de mostaza de la muestra analizada. 1 ml de nitrato de plata 0,1N corresponde a 4,956 mg de isotiocianato de alilo. Expresar el resultado en porcentaje de la muestra.
24.6 Referencias. Primera Directiva de la Comisión de 15 de junio de 1971 (71/250/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 155, de 12 de julio de 1971.
25. Lactosa
25.1 Principio. El método permite determinar el contenido en lactosa de los piensos que contengan más del 0,5 por 100 de este producto.
Los azúcares se disuelven en el agua. La solución se somete a la fermentación por la levadura Saccharomyces cerevisiae, que deja intacta la lactosa. Previa defecación y filtración, el contenido en lactosa del filtrado se determina por el método de Luff-Schoorl.
25.2 Material y aparatos. Baño de agua provisto de termostato, regulado de 38 a 40 ºC.
25.3 Reactivos.
25.3.1 Suspensión de Saccharomyces cerevisiae. Poner en suspensión 25 g de levadura fresca en 100 ml de agua. La suspensión se conserva una semana como máximo en el refrigerador.
25.3.2 Solución Carrez I. Disolver en agua 24 g de acetato de cinc dihidrato Zn(CHOOO) · 2HO y 3 ml de ácido acético glacial. Completar a 100 ml con agua.
25.3.3 Solución Carrez II. Disolver en agua 10,6 g de hexacianoferrato (II) de potasio KFe(CN) · 3HO. Completar a 100 ml con agua.
25.3.4 Solución de ácido cítrico. Disolver 50 g de ácido cítrico (CHOHO) en 50 ml de agua.
25.3.5 Solución de carbonato de sodio. Disolver 143,8 g de carbonato de sodio anhidro en 300 ml aproximadamente de agua caliente. Dejar enfriar y enrasar a 300 ml.
25.3.6 Solución de sulfato de cobre. Disolver 25 g de sulfato de cobre pentahidrato (CuSO · 5HO), exento de hierro, en 100 ml de agua.
25.3.7 Reactivo de Luff-Schoorl. Verter con cuidado la solución de ácido cítrico (25.3.4) sobre la solución de carbonato de sodio (25.3.5). Añadir a continuación la solución de sulfato de cobre (25.3.6) y completar a 1 litro con agua. Dejar reposar una noche y filtrar. Controlar la normalidad del reactivo obtenido (Cu 0,1 N; NaCO 2N). El pH de la solución debe ser aproximadamente 9,4.
25.3.8 Granos de piedra pómez hervidos con ácido clorhídrico, lavados con agua y secados.
25.3.9 Solución al 30 por 100 (p/v) de ioduro de potasio.
25.3.10 Solución de ácido sulfúrico 6N.
25.3.11 Solución de tiosulfato de sodio 0,1N.
25.3.12 Solución de almidón. Mezclar 5 g de almidón con 30 ml de agua y añadir 1 litro de agua hirviendo. Hacer hervir durante tres minutos, dejar enfriar. Añadir 10 mg de ioduro de mercurio (II) como conservador.
25.4 Procedimiento. Pesar, con precisión de 1 mg, 1 gramo de muestra en un matraz aforado de 100 ml. Añadir de 25 a 30 ml de agua. Colocar el matraz durante treinta minutos en un baño de agua hirviendo y refrigerar hasta 35 ºC aproximadamente. Añadir 5 ml de suspensión de levadura (25.3.1) y homogeneizar. Dejar reposar el matraz durante dos horas en un baño de agua, a la temperatura de 38 a 40 ºC. Refrigerar a continuación hasta 20 ºC aproximadamente.
Añadir 2,5 ml de solución de Carrez I (25.3.2) y agitar durante treinta segundos, añadir 2,5 ml de solución Carrez II y agitar, completar con agua a 100 ml, mezclar y filtrar. Tomar con pipeta un volumen del filtrado que no exceda 25 ml y que contenga entre 40 a 80 mg de lactosa e introducir en un erlenmeyer de 300 ml. Si fuese necesario completar a 25 ml con agua.
Efectuar de igual forma un ensayo en blanco con 5 ml de suspensión de levadura.
Añadir 25 ml exactamente, del reactivo Luff-Schoorl (25.3.7), dos gránulos de piedra pómez (25.2.8). Calentar, agitando manualmente, sobre una llama libre de media altura y llevar el líquido a ebullición durante dos minutos aproximadamente, colocar inmediatamente el erlenmeyer sobre una tela metálica provista de una pantalla de amianto con un agujero de 6 cm de diámetro aproximadamente, bajo la que se ha encendido previamente una llama. Esta se regula de forma que sólo se caliente el fondo del erlenmeyer. Adaptar a continuación un refrigerante a reflujo sobre el erlenmeyer. A partir de este momento, hacer hervir durante diez minutos exactamente, refrigerar inmediatamente en agua fría y, después de aproximadamente cinco minutos, valorar tal como se indica:
Añadir 10 ml de solución de yoduro de potasio (25.3.9) e inmediatamente después y con cuidado (debido al riesgo de formación de espuma abundante) 25 ml de ácido sulfúrico 6N (25.2.10). Valorar a continuación con la solución de tiosulfato de sodio 0,1N (25.3.11) hasta la aparición de una coloración amarilla clara, añadir el indicador (25.3.12) y terminar la valoración.
Efectuar la misma valoración sobre una mezcla medida con exactitud de 25 ml de reactivo Luff-Schoorl (25.3.7) y 25 ml de agua, después de haber añadido 10 ml de solución de yoduro de potasio (25.3.9). y 25 ml de ácido sulfúrico 6N (25.3.10) sin llevar a ebullición.
25.5 Cálculos. Establecer mediante la tabla adjunta la cantidad de lactosa en mg que corresponde a la diferencia ente los resultados de las dos valoraciones expresados en ml de tiosulfato de sodio 0,1N.
Expresar los resultados en partes de lactosa anhidro por cada cien de muestra.
25.6 Observaciones.
25.6.1 Para los productos que contengan más del 40 por ciento de los azúcares fermentados, emplear más de 5 ml de suspensión de levadura (25.3.1).
25.6.2 Efectuar paralelamente un ensayo con una cantidad conocida de lactosa monohidrato.
Tabla de valores para 25 ml de reactivo Luff-Schoorl
Na2S2O30,1N : ml / Glucosa fructosa azúcares invertidos C6H12O6 : mg / Diferencia / Lactosa C12H22O11 : mg / Diferencia / Maltosa C12H22O11 : mg / Diferencia
1 / 2,4 / 2,4 / 3,6 / 3,7 / 3,9 / 3,9
2 / 4,8 / 2,4 / 7,3 / 3,7 / 7,8 / 3,9
3 / 7,2 / 2,5 / 11,0 / 3,7 / 11,7 / 3,9
4 / 9,7 / 2,5 / 14,7 / 3,7 / 15,6 / 4,0
5 / 12,2 / 2,5 / 18,4 / 3,7 / 19,6 / 3,9
6 / 14,7 / 2,5 / 22,1 / 3,7 / 23,5 / 4,0
7 / 17,2 / 2,6 / 25,8 / 3,7 / 27,5 / 4,0
8 / 29,8 / 2,6 / 29,5 / 3,7 / 31,5 / 4,0
9 / 22,4 / 2,6 / 33,2 / 3,8 / 35,5 / 4,0
10 / 25,0 / 2,6 / 37,0 / 3,8 / 39,5 / 4,0
11 / 27,6 / 2,7 / 40,8 / 3,8 / 43,5 / 4,0
12 / 30,3 / 2,7 / 44,6 / 3,8 / 47,5 / 4,1
13 / 33,0 / 2,7 / 48,4 / 3,8 / 51,6 / 4,1
14 / 35,7 / 2,8 / 52,2 / 3,8 / 55,7 / 4,1
15 / 38,5 / 2,8 / 56,0 / 3,9 / 59,8 / 4,1
16 / 41,3 / 2,9 / 59,9 / 3,9 / 63,9 / 4,1
17 / 44,2 / 2,9 / 63,8 / 3,9 / 68,0 / 4,2
18 / 47,1 / 2,9 / 67,7 / 4,0 / 72,2 / 4,3
19 / 50,0 / 3,0 / 71,7 / 4,0 / 76,5 / 4,4
20 / 53,0 / 3,0 / 75,7 / 4,1 / 80,9 / 4,5
21 / 56,0 / 3,1 / 79,8 / 4,1 / 85,4 / 4,6
22 / 59,1 / 3,1 / 83,9 / 4,1 / 90,0 / 4,6
23 / 62,2 / / 88,0 / / 94,6 /
25.7 Referencias. Primera Directiva de la Comisión de 15 de junio de 1971 (71/250/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 155, de 12 de julio de 1971.
26. Potasio
26.1 Principio. La muestra se incinera y las cenizas se recogen en solución de ácido clorhídrico. El contenido en potasio de la solución se determina por fotometría de llama en presencia de cloruro de cesio y de nitrato de aluminio. La adición de dichas sustancias elimina, en una amplia medida, la interferencia de elementos perturbadores.
El método permite determinar el contenido de potasio en piensos.
26.2 Material y aparatos.
26.2.1 Crisoles de incineración de platino, cuarzo o porcelana, en su caso provistos de tapaderas.
26.2.2 Horno eléctrico, con termostato.
26.2.3 Fotómetro de llama.
26.3 Reactivos.
26.3.1 Acido clorhídrico p.a.; d = 1,12.
26.3.2 Cloruro de cesio p.a.
26.3.3 Nitrato de aluminio nono-hidrato Al(NO) · 9HO químicamente puro.
26.3.4 Cloruro de potasio p.a. anhidro.
26.3.5 Solución tampón. Disolver en agua 50 g de cloruro de cesio (26.3.2) y 250 g de nitrato de aluminio (26.3.3), completar a 1 litro con agua y homogeneizar. Conservar en frascos de material plástico.
26.3.6 Solución patrón de potasio. Disolver en agua 1,907 g de cloruro de potasio (26.3.4), añadiendo 5 ml de ácido clorhídrico (26.3.1), completar a 1 litro con agua y homogeneizar. Conservar en frascos de material plástico. 1 ml de dicha solución contiene 1,00 mg de potasio.
26.4 Procedimiento.
26.4.1 Determinación. Pesar con precisión de 10 mg, aproximadamente 10 g de la muestra en un crisol de incineración e incinerar a 450 ºC durante tres horas. Después de enfriar, trasvasar cuantitativamente el residuo de incineración con la ayuda de 250 a 300 ml de agua, y después con 50 ml de ácido clorhídrico (26.3.1) a un matraz aforado de 500 ml. Después de haber cesado el posible desprendimiento de gas carbónico, calentar la solución y mantenerla durante dos horas a una temperatura cercana a 90 ºC, agitando de vez en cuando. Dejar enfriar a la temperatura ambiente, enrasar, agitar y filtrar. Introducir en un matraz aforado de 100 ml una parte alícuota del filtrado que contenga como mínimo 1,0 mg de potasio, añadir 10,0 ml de solución tampón (26.3.5) enrasar con agua y homogeneizar. Para contenidos más altos de potasio, diluir la solución a analizar en la proporción adecuada, antes de la adición de la solución tampón. El cuadro siguiente se da a título indicativo para una toma de muestras de 10 g aproximadamente.
Contenido supuesto de la muestra en potasio Porcentaje K / Factor de dilución / Parte alícuota de la solución ml
Hasta 0,1 / - / 50
0,1 a 0,5 / - / 10
0,5 a 1,0 / - / 5
1,0 a 5,0 / 1:10 / 10
5,0 a 10,0 / 1:10 / 5
10,0 a 20,0 / 1:20 / 5
Efectuar la medición por fotometría de llama a la longitud de onda de 768 nm. Calcular el resultado mediante la curva de calibrado.
26.4.2 Curva de calibrado. Introducir 10 ml exactamente de la solución patrón (26.3.6) en un matraz aforado de 250 ml, enrasar con agua y homogeneizar. Introducir en matraces aforados de 100 ml exactamente: 0, 5, 10, 15, 20 y 25 ml de dicha solución, que corresponden respectivamente a cantidades de potasio de 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; y 1,0 mg. Añadir en cada matraz 10,0 ml de solución tampón (26.3.5) enrasar con agua y homogeneizar. Efectuar las medidas como se indica en 26.4.1. El trazado de la curva de calibrado es lineal generalmente hasta una concentración en potasio de 1 mg en 100 ml de solución.
26.5 Cálculos. El contenido en potasio se expresará en porcentaje de muestra.
26.6 Observaciones. La adición de solución tampón (26.3.5) para eliminar la interferencia de elementos perturbadores no es siempre necesaria.
26.7 Referencias. Primera Directiva de la Comisión de 15 de junio de 1971 (71/250/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 155, de 12 de julio de 1971.
27. Sodio
27.1 Principio. La muestra se incinera y las cenizas se recogen en solución de ácido clorhídrico. El contenido en sodio de la solución se determina por fotometría de llama en presencia de cloruro de cesio y de nitrato de aluminio. La adición de estas sustancias elimina, en una amplia medida, la interferencia de elementos perturbadores.
El método permite determinar el contenido de sodio en piensos.
27.2 Material y aparatos.
27.2.1 Crisoles de incineración de platino, cuarzo o porcelana, en su caso provistos de tapaderas.
27.2.2 Horno eléctrico, con termostato.
27.2.3 Fotómetro de llama.
27.3 Reactivos.
27.3.1 Acido clorhídrico p.a., d = 1,12.
27.3.2 Cloruro de cesio, p.a.
27.3.3 Nitrato de aluminio nonahidrato, Al(NO) · 9HO, químicamente puro.
27.3.4 Cloruro de sodio p.a., anhidro.
27.3.5 Solución tampón. Disolver en agua 50 g de cloruro de cesio (27.3.2) y 250 g de nitrato de aluminio (27.3.3) completar a 1 litro con agua y homogeneizar. Conservar en frascos de material plástico.
27.3.6 Solución patrón de sodio. Disolver en agua 2,542 g cloruro de sodio (27.3.4) añadiendo 5 ml de ácido clorhídrico (27.3.1), completar a 1 litro con agua y homogeneizar. Conservar en frascos de material plástico. 1 ml de dicha solución contiene 1,00 mg de sodio.
27.4 Procedimiento.
27.4.1 Determinación. Pesar, con precisión de 10 mg, aproximadamente 10 g de la muestra en un crisol de incineración (27.2.1.) e incinerar a 450 ºC durante tres horas. Evitar proyección e inflamación. Previo enfriamiento, trasvasar cuantitativamente el residuo de incineración con ayuda de 250 a 300 ml de agua, y después con 50 ml de ácido clorhídrico (27.3.1) a un matraz aforado de 500 ml.
Después de haber cesado el posible desprendimiento de gas carbónico, calentar la solución y mantenerla durante dos horas a una temperatura cercana a 90 ºC, agitando de vez en cuando. Dejar enfriar a temperatura ambiente, enrasar con agua, agitar y filtrar. Introducir en un matraz aforado de 100 ml una alícuota del filtrado, que contenga como máximo 1,0 mg de sodio, añadir 10,0 ml de solución tampón (27.3.5), enrasar con agua y homogeneizar. Para contenidos más altos de sodio, diluir la solución a analizar en la proporción adecuada, antes de la adición de la solución tampón. La tabla siguiente se da a título informativo, para una toma de muestras de 10 g aproximadamente.
Contenido supuesto de la muestra en solución Porcentaje Na / Factor de dilución / Parte alícuota de la solución ml Hasta 0,1 / - / 50
0,1 a 0,5 / - / 10
0,5 a 1,0 / - / 5
1,0 a 5,0 / 1:10 / 10
5,0 a 10,0 / 1:10 / 5
10,0 a 20,0 / 1:20 / 5
Efectuar la medida mediante fotometría de llama a una longitud de onda de 589 nm.
Calcular el resultado mediante la curva de calibrado.
27.4.2 Curva de calibrado. Introducir exactamente 10 ml de la solución patrón (27.3.6) en un matraz aforado de 250 ml, enrasar con agua y homogenizar. En matraces aforados de 100 ml, introducir exactamente 0, 5, 10, 15, 20 y 25 ml de dicha solución que correspondan respectivamente a unas cantidades de sodio de 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; y 1,0 mg. Añadir en cada matraz 10,0 ml de solución tampón (27.3.5) enrasar con agua y homogeneizar. Efectuar las medidas como se indica en 27.4.1. El trazado de la curva de calibrado es lineal generalmente hasta una concentración en sodio de 1 mg en 100 ml de solución.
27.5 Cálculos. El contenido en sodio se expresará en porcentaje de muestra.
27.6 Observaciones.
27.6.1 Para los productos cuyo contenido en sodio sea superior al 4 por 100 es preferible incinerar la substancia durante dos horas en un crisol provisto de una tapadera. Después de enfriar, añadir agua, poner un residuo en suspensión con ayuda de un hilo de platino, secar e incinerar de nuevo durante dos horas en el crisol provisto de su tapadera.
27.6.2 Si la muestra está constituida únicamente por materiales minerales, proceder a la disolución, sin previa incineración.
27.7 Referencias. Primera Directiva de la Comisión de 15 de junio de 1971 (71/250/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 155, de 12 de julio de 1971.
28. Magnesio
28.1 Principio. Incineración de la muestra y tratamiento de las cenizas con ácido clorhídrico diluido. Si la muestra no contiene sustancias orgánicas, se disuelve directamente en ácido clorhídrico. La solución se diluye y el contenido en magnesio se determina por espectrofotometría de absorción atómica a 285,2 nm, por comparación con las soluciones de calibrado.
Está especialmente indicado para determinar los contenidos en magnesio inferiores al 5 por 100 en los
piensos.
28.2 Material y aparatos.
28.2.1 Crisoles de incineración de platino, cuarzo o porcelana.
28.2.2 Horno o mufla en termostato.
28.3 Reactivos.
28.3.1 Acido clorhídrico de d = 1,16, p.a.
28.3.2 Acido clorhídrico de d = 1,19, p.a.
28.3.3 Magnesio, en cinta o hilo, o sulfato de magnesio heptahidrato, p.a. (Mg SO7HO) secado en vacío a temperatura ambiente.
28.3.4 Solución de sal de estroncio (cloruro o nitrato) p.a. al 2,5 por 100 (p/v) de estroncio, p.a. (76,08 g de ClSr 6 HO/litro, o 60,38 g de (NO) Sr/litro).
28.3.5 Solución de calibrado de magnesio: pesar con precisión de 1 mg, 1 g de magnesio (28.3.3), separando previamente y con cuidado la película de óxido, o una cantidad correspondiente de sulfato de magnesio (28.3.3). Introducirlo en un matraz de 1.000 ml añadir 80 ml de ClH (28.3.1) disolver y completar a 1000 ml con HO desionizada. 1 ml de dicha solución contiene 1.000 mg de magnesio.
28.4 Procedimiento.
28.4.1 Preparación de la muestra.
28.4.1.1 Piensos formados exclusivamente por sustancias minerales:
a) Pesar con precisión de 1 mg, 5 g de la muestra e introducirlos en un matraz aforado de 500 ml con 250-300 ml de agua desionizada. Añadir 40 ml de ácido clorhídrico (28.3.1), llevar a ebullición lenta durante treinta minutos. Enfriar, enrasar con agua desionizada, homogeneizar y filtrar en vaso de precipitado con filtro de pliegues. Eliminar los 30 ml primeros del filtrado.
b) En presencia de sílice, tratar 5 g de la muestra con una cantidad suficiente (entre 15 y 30 ml) de ácido clorhídrico (28.3.2) y evaporar a sequedad sobre un baño de agua. Continuar tal y con se indica en (28.4.1.2) a partir de la tercera fase.
28.4.1.2 Piensos formados esencialmente por sustancias minerales. Pesar con precisión de 1 mg, 5 g de la muestra en un crisol e incinerar a 550 ºC en horno mufla hasta la obtención de cenizas exentas de partículas carbonosas.
Para eliminar la sílice añadir a las cenizas una cantidad suficiente (entre 15 y 30 ml) de ácido clorhídrico (28.3.2) y evaporar a sequedad sobre un baño de agua. Secar a continuación una hora en la estufa a 105 ºC. Recoger el residuo con 10 ml de ácido clorhídrico (28.3.1) y transvasar con la ayuda de agua desionizada caliente a un matraz aforado de 500 ml. Llevar a ebullición, dejar enfriar y enrasar con agua desionizada. Homogeneizar y filtrar en vaso a través de un filtro de pliegues. Eliminar los 30 ml primeros del filtrado.
28.4.1.3 Piensos formados esencialmente por sustancias orgánicas. Pesar con precisión de 1 mg, 5 g de la muestra en crisol (28.2.1) e incinerar en un horno mufla hasta la obtención de cenizas exentas de partículas carbonosas. Tratar las cenizas con 5 ml de ácido clorhídrico (28.3.2), evaporar a sequedad en baño de agua y secar a continuación durante una hora en estufa a 105 ºC, para insolubilizar la sílice.
Recoger el residuo con 5 ml de ácido clorhídrico (28.3.1), trasvasar con ayuda de agua desionizada caliente a un matraz aforado de 250 ml. Llevar a ebullición, dejar enfriar y enrasar con agua desionizada. Homogeneizar y filtrar en un vaso a través de un filtro de pliegues. Eliminar los 30 ml primeros del filtrado.
28.4.2 Medida de la absorción atómica.
28.4.2.1 Curva de calibrado. Preparar, diluyendo la solución de calibrado (28.3.5) con agua desionizada, al menos cinco soluciones de referencias de concentraciones crecientes, escogidas en función de la zona de medida óptima del espectrofotómetro. Añadir a cada solución 10 ml de solución de sal de estroncio (28.3.4) y completar al volumen de 100 ml con agua desionizada.
28.4.2.2 Preparación de la muestra. Diluir con agua desionizada una parte alícuota del filtrado obtenido en 28.4.1.1, 28.4.1.2 y 28.4.1.3 de forma que se obtenga una concentración en magnesio comprendida en los límites de concentración de las soluciones de referencia. La concentración en ácido clorhídrico de dicha solución no debe exceder de 0,4N. Añadir 10 ml de la solución de sal del estroncio (28.3.4) y completar al volumen de 100 ml con agua destilada.
Medir la absorción de la solución problema y la de las soluciones de referencia a una longitud de onda de 285,2 nm.
28.5 Cálculos. Calcular la cantidad de magnesio de la muestra a partir de las soluciones de referencia. Expresar el resultado en porcentaje de la muestra.
28.6 Observaciones. La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra, no debe de exceder del 5 por 100 en valor relativo.
28.7 Referencias. Cuarta Directiva de la Comisión, de 5 de diciembre de 1972 (73/46/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 83, de 30 de marzo de 1973.
29. Hierro
29.1 Principio. Determinación del oligoelemento hierro en los piensos y sus materias primas. El límite inferior de determinación es de 20 mg/kg. La muestra se disuelve en solución de ácido clorhídrico, previa destrucción de la materia orgánica. El hierro se determina, después de dilución apropiada, por espectrofotometría de absorción atómica.
29.2 Material y aparatos.
29.2.1 Horno mufla, de temperatura regulable.
29.2.2 Material de vidrio borosilicato resistente. Se recomendará utilizar un material que sirva exclusivamente para la dosificación del oligoelemento.
29.2.3 Cápsulas de platino y, eventualmente, de cuarzo.
29.2.4 Espectrofotómetro de absorción atómica, que responda a las exigencias de método, en lo que concierne a la sensibilidad y a la precisión requeridas dentro de los límites de utilidad que se emplea.
29.3 Reactivos.
29.3.1 Acido clorhídrico p.a., d = 1,19.
29.3.2 Acido clorhídrico 6N.
29.3.3 Acido clorhídrico 0,5N.
29.3.4 Acido fluorhídrico de 38-40 por 100 (v/v), con un contenido de hierro inferior a 1 mg/l y cuyo residuo de evaporación sea inferior a 10 mg/l (expresado en sulfatos).
29.3.5 Acido sulfúrico p.a. (d = 1,84).
29.3.6 Agua oxigenada de unos 100 volúmenes de oxígeno (30 por 100 en peso).
29.3.7 Solución patrón de hierro (1.000 microgramos de hierro/ml): Disolver 1 g de hierro en hilos p.a., en 200 ml de ácido clorhídrico 6N (29.3.2) añadir 16 ml de agua oxigenada (29.3.6) y completar con agua hasta 1 litro.
29.3.8 Solución patrón de trabajo (100 microgramos de hierro/ml): Tomar 10 ml de la solución patrón (29.3.7) y llevar a 100 ml con agua.
29.3.9 Solución de cloruro de lantano: Disolver 12 g de óxido de lantano en 150 ml de agua, añadir 100 ml de ácido clorhídrico 6N (29.3.2) y completar con agua hasta 1 litro.
29.4 Procedimiento.
29.4.1 Muestra que contenga compuestos orgánicos.
29.4.1.1 Incineración y preparación de la muestra a analizar.
i) Colocar de 5 a 10 g de la muestra pesados con una precisión de 0,2 mg, en una cápsula de cuarzo o de platino (29.2.3) (ver 29.6.6), secar en estufa a 105 ºC e introducir la cápsula en el horno mufla (29.2.1) frío. Cerrar el horno (ver 29.6.7) y elevar progresivamente la temperatura para alcanzar 450 a 475 ºC en noventa minutos aproximadamente. Mantener dicha temperatura durante cuatro a seis horas (por ejemplo durante la noche) para eliminar la materia carbonosa, abrir luego el horno y dejar enfriar (ver 29.6.8).
Humedecer las cenizas con agua, trasvasarlas a un vaso de precipitado de 250 ml. Enjuagar la cápsula con 5 ml de ácido clorhídrico (29.3.1) y trasvasar, lentamente y con precaución, la solución de enjuague al vaso de precipitado (se podrá producir una reacción violenta por formación de dióxido de carbono). Añadir luego gota a gota ácido clorhídrico (29.3.1), agitando al mismo tiempo el contenido del vaso de precipitado, hasta que cese la efervescencia. Evaporar a sequedad agitando periódicamente con una varilla de vidrio.
Añadir al residuo 15 ml de ácido clorhídrico 6N (29.3.2) y unos 120 ml de agua. Mezclar con la ayuda de una varilla de vidrio, dejar la misma en el vaso de precipitado y cubrir con un vidrio de reloj. Poner el líquido en ebullición suave y mantener la ebullición hasta que aparentemente ya no se disuelvan las cenizas. Filtrar usando un papel de filtro sin cenizas y recoger el filtrado en un matraz aforado de 250 ml. Lavar el vaso de precipitado y el filtro con 5 ml de ácido clorhídrico 6N (29.3.2.) caliente y por dos veces con agua hirviendo. Completar con agua hasta enrasar (la concentración en ácido clorhídrico será de 0,5N aproximadamente).
ii) Si el residuo que se queda en el filtro apareciese negro (carbonoso), colocarlo de nuevo en el horno e incinerar de 450 a 475 ºC. Dicha incineración, que requerirá únicamente algunas horas (tres a cinco horas aproximadamente), se completará cuando las cenizas aparezcan blancas o casi blancas. Disolver el residuo en unos 2 ml de ácido clorhídrico (29.3.1). Evaporar a sequedad y añadir 5 ml de ácido clorhídrico 6N (29.3.2). Calentar, filtrar la solución en el matraz aforado y completar con agua enrasar (la concentración en ácido clorhídrico será de 0,5N aproximadamente).
29.4.1.2 Preparación de las soluciones patrón. Preparar una gama de soluciones patrón a partir de la solución patrón de trabajo (29.3.8) de forma que cada solución patrón tenga una concentración en ácido clorhídrico de 0,5N aproximadamente y una concentración de cloruro de lantano que corresponda a 0,1 por 100 de lantano (p/v) (29.3.9). Las concentraciones escogidas del oligoelemento deberán encontrarse en la zona de sensibilidad del espectrofotómetro utilizado. El cuadro siguiente dará, a título de ejemplo, los tipos de composición de solución patrón; según el tipo y la sensibilidad del espectrofotómetro utilizado, podrá ser necesario escoger otras concentraciones:
Hierro
xg de Fe/ml / 0 / 0,5 / 1 / 2 / 3 / 4 / 5
ml de solución patrón de trabajo (29.3.8). / 0 / 0,5 / 1 / 2 / 3 / 4 / 5
(1 ml = 100 xg Fe) + ml ClH 6N (29.3.2). / 7 / 7 / 7 / 7 / 7 / 7 / 7
+ 10 ml de solución de cloruro de lantano (29.3.9)
Completar con agua hasta 100 ml
Si la muestra tuviese una relación ponderal
Ca + Mg
------T 2, se podrá omitir la adición de la solución P
de cloruro de lantano (29.3.9).
29.4.1.2.2 Preparación de la solución a analizar. Introducir con pipeta una alícuota de la solución preparada según (29.4.1.1) en un matraz aforado de 100 ml; añadir 10 ml de solución de cloruro de lantano (29.3.9). Completar con ácido clorhídrico 0,5N (29.3.3).
Si la muestra tuviese una relación ponderal
Ca + Mg
------T 2, se podrá omitir la adición de la solución P
de cloruro de lantano (29.3.9).
29.4.1.2.3 Prueba en blanco. Realizar una prueba en blanco que comprenda todas las etapas prescritas del procedimiento operativo, sin la presencia de la muestra. No se deberá utilizar la solución patrón 0 para la prueba en blanco.
29.4.1.2.4 Medida por absorción atómica. Medir la absorbancia de las soluciones patrón y de la solución a analizar, utilizando una llama oxidante de aire-acetileno a la longitud de onda de: 248,3 nm. Realizar cuatro veces cada medida.
29.4.2 Compuestos minerales. En ausencia de materia orgánica, será inútil la incineración previa. Aplicar el procedimiento operativo a partir del punto (29.4.1.1.i), segundo apartado (ver 29.6.6).
29.5 Cálculos. Calcular la concentración del oligoelemento en la solución a analizar mediante una curva de calibrado y expresar el resultado en mg de oligoelemento por kg de muestra (ppm).
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra por el mismo analista no deberán de sobrepasar:
- 5 mg/kg en valor absoluto, para el contenido en el oligoelemento hasta 50 mg/kg.
- 10 por 100 del resultado más elevado para los contenidos superiores a 50 y hasta 100 mg/kg.
- 10 mg/kg, en valor absoluto, para los contenidos superiores a 100 y hasta 200 mg/kg.
- 5 por 100 del resultado más elevado para los contenidos superiores a 200 mg/kg.
29.6 Observaciones.
29.6.1 El agua empleada para la preparación de reactivos y de las soluciones requeridas durante el análisis deberá estar exenta del catión a determinar. Se obtendrá, bien por doble destilación en un aparato de borosilicato o de cuarzo, bien por doble permutación en resina intercambiadora de iones.
29.6.2 Los reactivos deberán ser, al menos, de la calidad para análisis (p.a.). La ausencia del elemento a determinar, deberá controlarse por un ensayo en blanco. Si fuese necesario, se someterán los reactivos a una purificación más profunda.
29.6.3 Se podrán sustituir las soluciones patrón descritas por soluciones patrón comerciales con tal que las mismas sean garantizadas y controladas antes de su empleo.
29.6.4 Los forrajes verdes (frescos o deshidratados) pueden contener grandes cantidades de sílice vegetal que puedan retener el oligoelemento y que se deberán eliminar. Se someterán las muestras de dichos piensos al siguiente tratamiento: efectuar la operación (29.4.1.1) hasta la fase de filtración. Lavar el papel de filtro, que contenga el residuo insoluble, por dos veces con agua hirviendo y colocarlo en una cápsula de platino (29.2.3). Incinerar en el horno mufla (29.2.1) a una temperatura inferior a 550 ºC hasta que toda la materia carbonosa haya desaparecido por completo. Dejar enfriar, añadir algunas gotas de agua y de 10 a 15 ml de ácido fluorhídrico (29.3.4). Evaporar a sequedad a 150 ºC aproximadamente. Si el residuo contiene aún sílice, disolver la misma en algunos ml de ácido fluorhídrico (29.3.4) y evaporar a sequedad. Añadir cinco gotas de ácido sulfúrico (29.3.5) y calentar hasta desaparición de los humos blancos. Añadir 5 ml de ácido clorhídrico 6N (29.3.2) y 30 ml aproximadamente de agua, calentar, filtrar la solución en un matraz aforado de 250 ml y completar hasta enrasar (la concentración de ácido clorhídrico será de 0,5N aproximadamente). Proseguir el procedimiento a partir del punto (29.4.1.2).
29.6.5 Al determinar el oligoelemento será oportuno llamar la atención en cuanto a los riesgos de contaminación. Por ello, los instrumentos utilizados para la preparación de las muestras deberán estar exentos de dicho metal.
Para reducir los riesgos de contaminación convendrá trabajar en atmósferas exentas de polvo, con un material rigurosamente limpio y aparatos de vidrio cuidadosamente lavados.
29.6.6 Calcular el peso de la muestra en función del contenido aproximado en el pienso del oligoelemento a valorar y de la sensibilidad del espectrofotómetro utilizado. Para determinados piensos pobres en el oligoelemento podrá ser necesario extraer una muestra de 10 a 20 g y limitar el volumen de la solución final a 100 ml.
29.6.7 Incinerar en un horno cerrado sin inyección de aire o de oxígeno.
29.6.8 La temperatura no deberá sobrepasar los 475 ºC.
29.7 Referencias. Octava Directiva de la Comisión de 15 de junio de 1978 (78/633/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 206 de 29 de julio de 1978.
30. Cobre
30.1 Principio. Determinación del oligoelemento cobre en los piensos y sus materias primas. El límite inferior de determinación es de 10 mg/kg. La muestra se disuelve en solución de ácido clorhídrico, previa destrucción de la materia orgánica. El cobre se determina, después de dilución apropiada, por espectrometría de absorción atómica.
30.2 Material y aparatos. Idem 29.2.
30.3 Reactivos. Idem 29.3. hasta 29.3.6. inclusive.
30.3.7 Solución patrón de cobre (100 microgramos de cobre/ml). Disolver 1 g de cobre en polvo p.a. en 25 ml de ácido clorhídrico 6N (29.3.2), añadir 5 ml de agua oxigenada (29.3.6) y completar con agua hasta 1 l.
30.3.8 Solución patrón de trabajo (10 microgramos de cobre/ml). Tomar 10 ml de la solución patrón (30.3.7 ) y llevar a 1.000 ml con agua.
30.4 Procedimiento. Idem 29.4. hasta 29.4.1.2.
30.4.1.2 Determinación espectrofotométrica.
30.4.1.2.1 Preparación de las soluciones patrón a partir de la solución de trabajo (30.3.8) de forma que cada solución patrón tenga una concentración de ácido clorhídrico de 0,5N aproximadamente. Las concentraciones escogidas del oligoelemento deberán encontrarse en la zona de sensibilidad del espectrofotómetro utilizado.
El cuadro siguiente dará, a título de información, los tipos de composición de la solución patrón; según el tipo y la sensibilidad del espectrofotómetro utilizado, podrá ser necesario escoger otras concentraciones:
Cobre
xg Cu/ml / 0 / 0,1 / 0,2 / 0,4 / 0,6 / 0,8 / 1,0
ml de solución patrón de trabajo (30.3.8). / 0 / 1 / 2 / 4 / 6 / 8 / 10
(1 ml = 100 xg Cu) + ml ClH 6N (29.3.2). / 8 / 8 / 8 / 8 / 8 / 8 / 8
Completar con agua hasta 100 ml
30.4.1.2.2 Preparación de la solución a analizar. La solución preparada según (29.4.1.1) podrá, como norma general, utilizarse directamente. Si fuese necesario llevar su concentración a la gama de las concentraciones de las soluciones patrón, se podrá introducir con pipeta una alícuota en un matraz aforado de 100 ml y completar con ácido clorhídrico 0,5N (29.3.3) hasta enrasar.
30.4.1.2.3 Prueba en blanco. Idem 29.4.1.2.3.
30.4.1.2.4 Medida por absorción atómica.
Medir la absorbancia de las soluciones patrón y de la solución a analizar, utilizando una llama oxidante de aire-acetileno, con una longitud de onda de 324,8 nm. Realizar cuatro veces cada medida.
30.4.2 Compuestos minerales. Idem 29.4.2.
30.5 Cálculos. Idem 29.5.
30.6 Observaciones. Idem 29.6.
30.7 Referencias. Idem 29.
31. Manganeso
31.1 Principio. Determinación del oligoelemento manganeso en los piensos y sus materias primas. El límite inferior de determinación será de 20 mg/kg. La muestra se disuelve en solución de ácido clorhídrico, previa destrucción de la materia orgánica. El manganeso se determina, después de dilución apropiada, por espectrofotometría de absorción atómica.
31.2 Material y aparatos. Idem 29.2.
31.3 Reactivos. Idem 29.3. hasta 29.3.6. inclusive.
31.3.7 Solución patrón de manganeso (1.000 microgramos Mn/ml): disolver 1 g de manganeso polvo p.a. en 25 ml de ácido clorhídrico 6N (29.3.2) y completar con agua hasta 1 litro.
31.3.8 Solución patrón de trabajo (10 microgramos Nm/ml): tomar 10 ml de la solución patrón (31.3.7) y llevar a 1.000 ml con agua.
31.3.9 Idem 29.3.9.
31.4 Procedimiento. Idem 29.4 hasta 29.4.1.2.3, inclusive, a excepción del cuadro de los tipos de composición de la solución patrón.
Manganeso
xG Mn/ml / 0 / 0,1 / 0,2 / 0,4 / 0,6 / 0,8 / 1,0
ml de solución patrón de trabajo (31.3.8). / 0 / 1 / 2 / 4 / 8 / 8 / 10
(1 ml = 10 xg Mn) + ml ClH 6N(29.3.2). / 7 / 7 / 7 / 7 / 7 / 7 / 7
+ 10 ml de solución de cloruro de lantano (29.3.9).
Completar con agua hasta 100 ml
31.4.1 Medida por absorción atómica. Medir la absorbancia de las soluciones patrón y de la solución a analizar, utilizando una llama oxidante aire-acetileno con una longitud de onda de 279,5 nm. Realizar cuatro veces cada medida.
31.4.2 Idem 29.4.2.
31.5 Cálculos. Idem 29.5.
31.6 Observaciones. Idem 29.6.
31.7 Referencias. Idem 29.7.
32. Cinc
32.1 Principio. Determinación del oligoelemento cinc en los piensos y sus materias primas. El límite inferior de determinación será de 20 mg/kg. La muestra se disuelve en solución de ácido clorhídrico, previa destrucción de la materia orgánica. El cinc se determina, después de dilución apropiada, por espectrofotometría de absorción atómica.
32.2 Material y aparatos. Idem 29.2.
32.3 Reactivos. Idem 29.3 hasta 29.3.6, inclusive.
32.3.7 Solución patrón de cinc (100 microgramos Zn/ml): disolver 1 g de cinc en cinta o placa, p.a., en 25 ml de ácido clorhídrico 6N (29.3.2) y completar con agua hasta 1 litro.
32.3.8 Solución patrón de trabajo (10 microgramos Zn/ml): tomar 10 ml de la solución patrón (32.3.7) y llevar a 100 ml con agua.
32.3.9 Idem 29.3.9.
32.4 Procedimiento. Idem 29.4 hasta 29.4.1.2.3, inclusive, a excepción del cuadro de los tipos de composición de la solución patrón.
Cinc
xG Zn/ml / 0 / 0,05 / 0,1 / 0,2 / 0,4 / 0,6 / 0,8
ml de solución patrón de trabajo (32.3.8). / 0 / 0,05 / 1 / 2 / 4 / 6 / 8
(1 ml = 10 xg Zn) + ml ClH 6N(29.3.2). / 7 / 7 / 7 / 7 / 7 / 7 / 7
+ 10 ml de solución de cloruro de lantano (29.3.9). Completar con agua hasta 100 ml
32.4.1 Medida por absorción atómica. Medir la absorbancia de las soluciones patrón y de la solución a analizar, utilizando una llama oxidante aire-acetileno con una longitud de onda de 213,8 nm. Realizar cuatro veces cada medida.
32.4.2 Idem 29.4.2.
32.5 Cálculos. Idem 29.5.
32.6 Observaciones. Idem 29.6.
Además tener en cuenta (29.6.5) que la determinación del cinc es especialmente sensible a las contaminaciones procedentes de los aparatos de vidrio, de los reactivos, del polvo y de otros elementos perturbadores.
32.7 Referencias. Idem 29.7.
33. Humedad de las grasas y aceites animales
y vegetales
33.1 Principio. La muestra se somete a desecación a 103 ºC hasta peso constante.
Este método permite determinar el contenido en humedad (agua y otras materias volátiles) de las grasas y aceites animales y vegetales.
33.2 Material y aparatos.
33.2.1 Recipientes de fondo plano, de material resistente a la corrosión con diámetro de 8-9 cm y altura de aproximadamente 3 cm.
33.2.2 Termómetro de mercurio, de bulbo reforzado y cámara de dilatación en el extremo superior, graduado de 80 a 110 ºC como mínimo y de una longitud de 10 cm aproximadamente.
33.2.3 Baño de arena o placa calefactora eléctrica.
33.2.4 Desecador conteniendo un deshidratante eficaz.
33.2.5 Balanza analítica.
33.3 Procedimiento. Pesar, con precisión de 1 mg, 20 g aproximadamente de la muestra homogeneizada, en el recipiente (33.2.1), seco y tarado, conteniendo el termómetro (33.2). Calentar sobre baño de arena o placa calefactora (33.2.3.), agitando constantemente con la ayuda del termómetro, de forma que la temperatura llegue a 90 ºC en siete minutos aproximadamente.
Elevar la temperatura lentamente, sin superar los 105 ºC, agitando con el termómetro hasta el cese de burbujas.
Para garantizar la completa eliminación de la humedad, repetir varias veces el calentamiento a 103 ºC ± 2 ºC, enfriar a continuación en desecador (33.2.4) hasta temperatura ambiente y pesar. Repetir esta operación hasta que la diferencia entre dos pesadas sucesivas no exceda en más de 2 mg.
33.4 Cálculos. El contenido en humedad de la muestra, en porcentaje, viene dado por la fórmula:
(P - P) x 100
(P - P) x 100
(P - P) x P
Siendo:
P = Peso, en gramos, de la muestra.
P = Peso, en gramos, del recipiente con su contenido, antes del calentamiento.
P = Peso, en gramos, del recipiente con su contenido, después del calentamiento.
Los resultados por debajo del 0,05 por 100 deben expresarse como menos del 0,05 por 100.
33.5 Observaciones.
33.5.1 Un incremento del peso de la muestra después de un calentamiento repetido indica una oxidación de la grasa. En este caso hacer el cálculo a partir de la pesada efectuada inmediatamente antes de aparecer este incremento de peso.
33.5.2 La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre una misma muestra no debe exceder del 0,05 por 100 en valor absoluto.
33.6 Referencias. Cuarta Directiva de la Comisión de 5 de diciembre de 1972. (73/46/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 83, de 30 de marzo de 1973.
34(a). Almidón (método polarimétrico)
34(a).1 Principio. El método comprende una doble determinación. En la primera, la muestra se trata en caliente mediante ácido clorhídrico diluido. Previa defecación y filtración, se medirá mediante un polarímetro el poder rotatorio de la solución.
En el segundo, la muestra se extrae mediante etanol al 40 por 100. Tras la acidificación del filtrado por el ácido clorhídrico, defecación y filtración, se mide el poder rotatorio en las mismas condiciones que en la primera determinación.
La diferencia entre las dos multiplicada por un factor común da como resultado el contenido en almidón de la muestra.
El método permite determinar el contenido en almidón y sus productos de degradación de alto peso molecular en los piensos, excepto de aquellos que contienen peladuras, pulpas, hojas o cuellos secos de remolacha, pulpa de patata, levadura deshidratada, productos ricos en inulina (por ejemplo, peladuras y harina de chufas) o chicharrones.
34(a).2 Material y aparatos.
34(a).2.1 Erlenmeyer de 250 ml de boca esmerilada, con refrigerante de reflujo.
34(a).2.2 Polarímetro o sacarímetro.
34(a).3 Reactivos.
34(a).3.1 Acido clorhídrico al 25 por 100 (p/p), d = 1,126.
34(a).3.2 Acido clorhídrico al 1,128 por 100 (p/v). La concentración debe comprobarse mediante valoración con la ayuda de una solución de hidróxido de sodio 0,1N en presencia de rojo de metilo al 0,1 por 100 (p/v) en etanol al 94 por 100 (v/v) (10 ml = 30,94 ml de NaOH 0,1N).
34(a).3.3 Solución de Carrez I: Disolver en agua 21,9 g de acetato de cinc dihidrato (Zn(CH - COO) . 2HO) y 3 g de ácido acético glacial. Completar a 100 ml con agua.
34(a).3.4 Solución de Carrez II: Disolver en agua 10,6 g de ferrocianuro de potasio trihidrato (KFe(CN) . 3HO). Completar con agua.
34(a).3.5. Etanol al 40 por 100 (v/v), d = 0,948 a 20 ºC.
34(a).4 Procedimiento.
34(a).4.1 Preparación de la muestra. Moler la muestra de forma que pase en su totalidad a través de un tamiz de malla de 0,5 mm.
34(a).4.2 Determinación del poder rotatorio total (P o S) (v. observaciones (34.(a).6.1).
Pesar, con precisión de 1 mg, 2,5 g de la muestra molida e introducir en un matraz aforado de 100 ml. Añadir 25 ml de ácido clorhídrico (34(a).3.2), agitar para obtener un buen reparto de la muestra y añadir de nuevo 25 ml de ácido clorhídrico (34(a).3.2). Sumergir el matraz en un baño de agua hirviendo y, durante los tres primeros minutos siguientes agitar enérgicamente y con regularidad para evitar la formación de aglomerados. La cantidad de agua del baño debe ser suficiente para permitir mantener el baño en ebullición cuando el matraz esté sumergido en él. Este no podrá ser retirado del baño a lo largo de la agitación. Después de quince minutos exactamente, retirar el matraz del baño, añadir 30 ml de agua fría y enfriar inmediatamente hasta 20 ºC.
Añadir 5 ml de la solución de Carrez I (34(a).3.3) y agitar durante un minuto. Añadir a continuación 5 ml de solución de Carrez II (34(a).3.4) y agitar de nuevo, durante un minuto. Completar el volumen con agua, homogeneizar y filtrar. Si el filtrado no está perfectamente límpido (lo que es poco frecuente), volver a comenzar el análisis empleando una cantidad mayor de las soluciones de Carrez I y II, por ejemplo 10 ml.
Medir a continuación el poder rotatorio de la solución en un tubo de 200 mm mediante un polarímetro o un sacarímetro.
34(a).4.3 Determinación del poder rotatorio (P' o S') de las sustancias solubles en el etanol al 40 por 100.
Pesar, con precisión de 1 mg, 5 g de la muestra, introducirlos en un matraz aforado de 100 ml y añadir 80 ml aproximadamente de etanol (34(a).3.5) (v. observaciones 34(a).6.2). Dejar el matraz en reposo durante una hora a temperatura ambiente, a lo largo de este lapso de tiempo, proceder cinco veces a una agitación enérgica de forma que la toma de muestra esté bien mezclada con el etanol. Llevar después a volumen con el etanol (34(a).3.5), homogeneizar y filtrar.
Introducir mediante pipeta 50 ml del filtrado (=2,5 g de la muestra) en un erlenmeyer de 250 ml. Añadir 2,1 ml. Añadir 2,1 ml de ácido clorhídrico (34(a).3.1) y agitar enérgicamente. Ajustar un refrigerante a reflujo al erlenmeyer y sumergirlo en un baño de agua hirviendo. Después de quince minutos exactamente, retirar el erlenmeyer del baño, trasvasar su contenido a un matraz aforado de 100 ml lavando con un poco de agua fría y enfriar hasta 20 ºC. Defecar a continuación con ayuda de las soluciones de Carrez I (34(a).3.3) y Carrez II (34(a).3.4), completar a volumen con agua, homogeneizar filtrar y medir el poder rotatorio como se indica en 34(a).4.2, párrafos segundo y tercero.
34(a).5 Cálculos. El contenido en almidón en porcentaje de muestra se obtiene mediante las siguientes fórmulas:
34(a).5.1 Mediciones efectuadas con polarímetro.
% de almidón = 2000 (P - P')
% de almidón = 2000 (P - P')
% de almidón = (u)
Siendo:
P = Poder rotatorio total en grados de arco.
P' = Poder rotatorio en grados de arco para las sustancias solubles en etanol al 40 por 100.
(u) = Poder rotatorio específico del almidón puro. Los valores convencionales admitidos para dicho factor son los siguientes:
+ 185,9º: almidón de arroz.
+ 185,4º: almidón de patata.
+ 184,6º: almidón de maíz.
+ 182,7º: almidón de trigo.
+ 181,5º: almidón de cebada.
+ 181,3º: almidón de avena.
+ 184,0º: otros tipos de almidón, así como mezclas de almidones de los piensos compuestos.
34(a).5.2 Mediciones efectuadas mediante sacarímetro.
% de almidón = 2000 · (2N x 0,665)(S - S') =
% de almidón = 2000 · 2N x 0,665)(S - S') =
% de almidón = (u) · 100 =
= 26,6N ( - S')
= 26,6N ( - S')
= (u)
Siendo:
S = Poder rotatorio total en grados sacarímetros.
S' = Poder rotatorio en grados sacarimétricos dado por las sustancias solubles en el etanol al 40 por 100.
N = Peso, en g, de sacarosa en 100 ml de agua dando, bajo un espesor de 200 mm, un poder rotatorio de 100º sacarimétricos.
16,29 para los sacarímetros franceses.
26,00 para los sacarímetros alemanes.
20,00 para los sacarímetros mixtos.
(u) = poder rotatorio específico del almidón puro (34(a).5.1).
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre una misma muestra no debe exceder del 0,4 en valor absoluto para los contenidos en almidón inferiores al 40 por 100; 1,1 por 100 en valor relativo para los contenidos en almidón iguales o superiores al 40 por 100.
34(a).6 Observaciones.
34(a).6.1 Cuando la muestra contenga más del 6 por 100 de carbonatos calculados en carbonato de calcio, éstos deben ser destruidos mediante un tratamiento con ayuda de una cantidad exactamente apropiada de ácido sulfúrico diluido, antes de la determinación del poder rotatorio total.
34(a).6.2 En el caso de los productos de elevado contenido en lactosa, tales como el polvo de suero láctico o de leche descremada, proceder como sigue después de la adición de los 80 ml de etanol (34(a).3.5). Ajustar al matraz un refrigerante de reflujo, sumergir el matraz durante treinta minutos en un baño de agua a 50 ºC. Dejar a continuación enfriar y seguir con el análisis tal como se indica en (34(a).3.5).
34(a).7 Referencias. Tercera Directiva de la Comisión de 27 de abril de 1972. (72/199/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 123, de 29 de mayo de 1972.
34(b). Almidón (método de la pancreatina)
34(b).1 Principio. Los azúcares presentes en la muestra son eliminados por extracción con etanol. El almidón del residuo de extracción es sacarificado por la pancreatina. Los azúcares son hidrolizados por el ácido clorhídrico y la glucosa formada es valorada por el método de Luff-Schoorl. La cantidad de glucosa obtenida multiplicada por un factor constante da el contenido en almidón de la muestra.
El método permite determinar el contenido en almidón y productos de su degradación de elevado peso molecular en los alimentos que contienen peladuras, pulpa, hojas o cuellos desecados de remolacha, pulpa de patata, levaduras deshidratadas, productos ricos en inulina (por ejemplo fracciones y harina de chufas o de patatas). La valoración debe ser realizada solamente cuando el examen microscópico indica la presencia en la muestra de cantidades apreciables de almidón.
34(b).2 Material y aparatos.
34(b).2.1 Extractor (ver figura 34(b).1) que se compone de:
34(b).2.1.1 Matraz erlenmeyer de 500 ml de cuello largo.
34(b).2.1.2 Refrigerante de reflujo adaptado al matraz erlenmeyer.
34(b).2.1.3 Varilla corrediza situada en el tubo central del refrigerante provista de un gancho en su extremidad inferior y una pinza para fijar la varilla.
34(b).2.1.4 Cestillo metálico, destinado a ser suspendido del gancho de la varilla (34(b).2.1.3) y a soportar el crisol filtrante (34(b).2.1.5).
34(b).2.1.5 Crisol de placa filtrante, dimensión máxima del poro: 90-150 micrometros (por ejemplo, G1), de aproximadamente 30 ml de capacidad.
34(b).2.1.6 Filtros de papel de formato adecuado al crisol filtrante (34(b).2.1.5).
34(b).2.2 Estufa de incubación regulada a 38 ºC.
34(b).2.3 Matraces aforados de 200 ml con boca esmerilada normalizada y refrigerante de reflujo.
34(b).2.4 Matraces aforados 100 ml con boca esmerilada normalizada y refrigerante de reflujo.
34(b).3 Reactivos.
34(b).3.1 Etanol 90 por 100 (V/V) neutro a la fenolftaleína.
34(b).3.2 Alcohol n-amílico p.a.
34(b).3.3 Tolueno p.a.
34(b).3.4 Solución tampón. Disolver en agua 9,078 g de fosfato monopotásico KPOH y 11,876 g de fosfato disódico dihidrato NaPOH . 2HO. Completar a un litro con agua.
34(b).3.5 Solución de cloruro de sodio: 0,2N.
34(b).3.6 Solución de Carrez I. Disolver en agua 21,9 g de acetato de cinc dihidrato Zn(CHCOO) . 2HO y 3 g de ácido acético glacial. Completar a 100 ml con agua.
34(b).3.7 Solución de Carrez II. Disolver en agua 10,6 g de ferrocianuro potásico trihidrato K4(Fe (CN)) . 3HO. Completar a 100 ml con agua.
34(b).3.8 Acido clorhídrico 1N.
34(b).3.9 Acido clorhídrico p.a. aproximadamente 8N (d = 1,125).
34(b).3.10 Solución de hidróxido de sodio p.a. aproximadamente 10N (d = 1,33).
34(b).3.11. Indicador. Solución de naranja de metilo al 0,1 por 100 (P/V).
34(b).3.12 Pancreatina pulverulenta respondiendo a las prescripciones dadas en (34(b).6.3). Conservar en recipientes cerrados, protegidos de la luz y de la humedad.
34(b).3.13 Reactivo de Luff-Schoorl. Verter agitando cuidadosamente la solución de ácido cítrico (34(b).3.13.2) en la solución de carbonato de sodio (34(b).3.13.3). Añadir a continuación la solución de sulfato de cobre (34(b).3.13.1) y completar hasta un litro con agua. Dejar reposar una noche y filtrar. Controlar la normalidad del reactivo así obtenida (0,1N Cu, 2N NaCO). El pH será de 9,4 aproximadamente.
34(b).3.13.1 Solución de sulfato de cobre. Disolver 25 g de sulfato de cobre pentahidrato p.a. CuSO . 5HO en 100 ml de agua.
34(b).3.13.2 Solución de ácido cítrico. Disolver 50 g de ácido cítrico monohidrato p.a. CHO . HO en 50 ml de agua.
34(b).3.13.3 Solución de carbonato de sodio. Disolver 143,8 g de carbonato de sodio anhidro p.a. en 300 ml aproximadamente de agua caliente. Dejar enfriar.
34(b).3.14 Gránulos de piedra pómez hervidos con ácido clorhídrico lavados con agua y desecados.
34(b).3.15 Solución al 30 por 100 (p/v) de yoduro de potasio p.a.
34(b).3.16 Acido sulfúrico aproximadamente 6N (d = 1,18).
34(b).3.17 Solución de tiosulfato de sodio 0,1N.
34(b).3.18 Solución de almidón. Añadir una mezcla de 5 g de almidón soluble en 30 ml de agua, a 1 litro de agua hirviendo. Hervir durante tres minutos y luego dejar enfriar. Preparar inmediatamente antes de su empleo.
34(b).4 Procedimiento.
34(b).4.1 Preparación de la muestra. Moler la muestra de manera que pase totalmente a través de un tamiz de mallas de 0,5 mm.
34(b).4.2 Extracción. Pesar, con la precisión de 1 mg, 2 g de muestra e introducirlos en un crisol filtrante (34(b).2.1.5), cuyo fondo ha sido previamente recubierto con papel de filtro (34(b).2.1.6) humedecido con etanol ((34(b).3.1). Introducir en el matraz erlenmeyer (34(b).2.1.1)) 55 ml de etanol (35(b).3.1) y algunos gránulos de piedra pómez (34(b).3.14). Situar el crisol filtrante en el cestillo metálico (34(b).2.1.4) y suspenderlo del gancho de la varilla (34(b).2.1.3). Situar el refrigerante sobre el matraz erlenmeyer y bajar la varilla de forma que el fondo del crisol sobresalga de la superficie del etanol. Fijar la varilla a esta altura con la ayuda de la pinza. Llevar el etanol a ebullición y mantenerlo durante tres horas. Dejar enfriar a continuación y elevar la varilla (34(b).2.1.3) de forma que se eleve el crisol tan alto como sea posible en el matraz erlenmeyer. Destaparlo con cuidado y dejar caer 45 ml de agua a lo largo de la pared del erlenmeyer. Colocar de nuevo el refrigerante sobre el matraz y mantener el crisol filtrante a 10 cm del nivel del líquido. Llevar este líquido a ebullición y mantenerlo así tres horas. Enfriar inmediatamente, abrir el matraz y retirar el crisol del cestillo.
34(b).4.3 Sacarificación o hidrólisis. Situar el crisol filtrante en un recipiente vacío y desecar por aspiración. Depositar el residuo de extracción en un mortero y triturar finamente. Trasvasar cuantitativamente el polvo con ayuda de 60 ml de agua aproximadamente a un matraz redondo aforado de 200 ml esmerilado normalizado y añadir algunas gotas de alcohol amílico (34(b).3.2). Ajustar al recipiente un refrigerante de reflujo. Calentar a ebullición y mantener así durante una hora. A continuación enfriar y desconectar el refrigerante. Añadir 25 ml de solución tampón (34(b).3.4) y 250 mg de pancreatina (34(b).3.12) 2,5 ml de solución de cloruro sódico (34(b).3.5) de 10 gotas de tolueno. Agitar durante dos minutos, situar el recipiente en la estufa de incubación (34(b).2.2) y mantenerlo durante veintiuna horas, agitando de vez en cuando. A continuación dejar enfriar a temperatura ambiente.
Añadir 5 ml de solución de Carrez I (34(b).3.6) y agitar durante un minuto. Añadir a continuación 5 ml de solución Carrez II (34(b).3.7) agitar de nuevo durante un minuto. Completar el volumen con agua, homogeneizar y filtrar. Tomar con pipeta 50 ml de filtrado y llevarlos a un recipiente aforado de 100 ml. Añadir algunas gotas del indicador (34(b).3.11) y acidificar con ácido clorhídrico 8N (34(b).3.9) hasta que vire a rojo. Añadir a continuación 6,25 ml de ácido clorhídrico 8N, en exceso (12,5 ml si se actúa sobre 100 ml de filtrado). Acoplar el refrigerante de reflujo al recipiente, poner la solución a ebullición y mantenerla durante una hora. Dejar enfriar, neutralizar con la solución de hidróxido sódico 10N (34(b).3.10) hasta que vire a amarillo el indicador. Acidificar a continuación ligeramente añadiendo un poco de ácido clorhídrico 1N (34(b).3.3), completar el volumen con agua y homogeneizar. Determinar el contenido en glucosa con el método de Luff-Schoorl como se indica en (34(b).4.4).
34(b).4.4 Valoración según Luff Schoorl. Tomar con pipeta, 25 ml de reactivo Luff-Schoorl (34(b).3.13) y llevarlo a un erlenmeyer de 300 ml; añadir 25 ml, exactamente medidos, de la solución obtenida en (34(b).4.3) conteniendo un máximo de 60 mg de glucosa. Añadir dos trocitos de piedra pómez (34(b).3.14), calentar, agitando a mano, sobre una llama libre de una altura media, hasta que el líquido esté sometido a ebullición en dos minutos aproximadamente. Situar inmediatamente el erlenmeyer sobre una tela metálica con disco en amianto donde se ha hecho una abertura de aproximadamente 6 cm de diámetro, debajo de la cual se ha encendido previamente una llama. Esta se regula de forma que solamente se caliente el fondo del matraz. A continuación adaptar un refrigerante de reflujo al matraz. A partir de este momento someterlo a ebullición durante diez minutos exactamente. Enfriar inmediatamente en agua fría y después de cinco minutos, aproximadamente, valorar como sigue:
Añadir 10 ml de solución de yoduro de potasio (34(b).3.15) e inmediatamente con precaución (en razón del riesgo de formación de espuma abundante), añadir 25 ml de ácido sulfúrico 6N (34(b).3.16). Valorar a continuación con solución de tiosulfato de sodio 0,1N (34(b).3.17), hasta la aparición de una coloración amarilla suave; añadir como indicador la solución de almidón (34(b).3.18) y realizar la valoración hasta el final.
Efectuar la misma valoración sobre una mezcla exactamente medida de 25 ml de reactivo Luff-Schoorl (34(b).3.13) y 25 ml de agua, después añadir 10 ml de solución de yoduro potásico (34(b).3.15) y 25 ml de ácido sulfúrico 6N (34(b).3.16) sin poner a ebullición.
34(b).4.5 Ensayo en blanco. Efectuar un ensayo en blanco aplicando el modo operativo descrito en 34(b).4.3 y 34(b).4.4 en ausencia de la muestra.
34(b).5 Cálculos. Establecer con la ayuda de la tabla adjunta la cantidad de glucosa en mg correspondiente a la diferencia entre los resultados de las dos valoraciones (expresadas en ml de tiosulfato de sodio 0,1N) que se refieren tanto a la muestra como al ensayo en blanco.
El contenido en almidón expresado en porcentaje de la muestra viene dado por la siguiente fórmula:
0,72 (a - b)
En la que:
a = mg de glucosa en la muestra.
b = mg de glucosa en el ensayo en blanco (ver observación 34(b).6.2.).
34(b).6 Observaciones.
34(b).6.1 La presencia simultánea en la muestra de almidón parcialmente dextrinado a la lactosa puede dar lugar a un resultado con un exceso de 0,5 a 3 por 100 de almidón. En este caso, el contenido real en almidón se obtiene como sigue:
a) Determinar el contenido en azúcares reductores del extracto etanólico obtenido en (34(b).4.2) y expresar el resultado en porcentaje de glucosa.
b) Determinar el contenido en la muestra de azúcares reductores, solubles en agua y expresar el resultado en porcentaje de glucosa.
c) Restar el resultado obtenido en a) del obtenido en b) y multiplicar la diferencia por 0,9.
d) Restar el valor obtenido en c) del contenido en almidón obtenido por la aplicación del método y calcularlo como se indica en (34(b).5).
34(b).6.2 La cantidad de glucosa en el ensayo en blanco es normalmente de 0,25 mg y no puede ser superior a 0,50 mg.
34(b).6.3 Prescripciones concernientes a la pancreatina:
Aspecto físico: Polvo blanco amarillo, amorfo.
Contenido en glucosa: La cantidad de glucosa del ensayo en blanco (ver 34(b).4.5) normalmente es de 0,25 mg. Un resultado superior a 0,50 indica que la pancreatina no se puede utilizar.
Control de consumo de iodo: Poner en suspensión 62,5 mg de pancreatina en 50 ml de agua y llevar a 25-30 ºC. Añadir 1 ml de solución de iodo 0,1N. Remover durante dos minutos. Valorar con una solución de tiosulfato de sodio 0,1N (34(b).3.17) en presencia del indicador de almidón. El consumo de solución de iodo por la pancreatina no debe pasar de 0,5 ml.
Control de la actividad amilolítica: Mezclar 100 ml de solución de almidón (34(b).3.18), 5 ml de la solución tampón (34(b).3.4), 0,5 ml de la solución de cloruro sódico (34(b).3.5) y 62,5 mg de pancreatina. La mezcla se calienta a 25-30 ºC y se remueve durante dos minutos. Luego se añade 1 ml de solución de iodo 0,1N. La coloración azul debe desaparecer antes de los quince minutos que siguen a la adición de la solución de iodo.
34(b).7 Referencias. Quinta Directiva de la Comisión de 25 de marzo de 1974. (74/203/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 108/7, de 22 de abril de 1974.
Tabla de valores para 25 ml de reactivo
según Luff-Schoorl
ml de Na2S20301N, dos minutos de calentamiento, diez minutos de ebullición
NaS2030,1N :ml / Glucosa, fructosa, azúcares invertidos C6H1206 : mg / Diferencia / Lactosa C12H22011 : mg / Diferencia / Maltosa C12H22011 : mg / Diferencia
1 / 2,4 / 2,4 / 3,6 / 3,7 / 3,9 / 3,9
2 / 4,8 / 2,4 / 7,3 / 3,7 / 7,8 / 3,9
3 / 7,2 / 2,5 / 11,0 / 3,7 / 11,7 / 3,9
4 / 9,7 / 2,5 / 14,7 / 3,7 / 15,6 / 4,0
5 / 12,2 / 2,5 / 18,4 / 3,7 / 19,6 / 3,9
6 / 14,7 / 2,5 / 22,1 / 3,7 / 23,5 / 4,0
7 / 17,2 / 2,6 / 25,8 / 3,7 / 27,5 / 4,0
8 / 19,8 / 2,6 / 29,5 / 3,7 / 31,5 / 4,0
9 / 22,4 / 2,6 / 33,2 / 3,8 / 35,5 / 4,0
10 / 25,0 / 2,6 / 37,0 / 3,8 / 39,5 / 4,0
11 / 27,6 / 2,7 / 40,8 / 3,8 / 43,5 / 4,0
12 / 30,3 / 2,7 / 44,6 / 3,8 / 47,5 / 4,1
13 / 33,0 / 2,7 / 48,4 / 3,8 / 51,6 / 4,1
14 / 35,7 / 2,8 / 52,2 / 3,8 / 55,7 / 4,1
15 / 38,5 / 2,8 / 56,0 / 3,9 / 59,8 / 4,1
16 / 41,3 / 2,9 / 59,9 / 3,9 / 63,9 / 4,1
17 / 44,2 / 2,9 / 63,8 / 3,9 / 68,0 / 4,2
18 / 47,1 / 2,9 / 67,7 / 4,0 / 72,2 / 4,3
19 / 50,0 / 3,0 / 71,7 / 4,0 / 76,5 / 4,4
20 / 53,0 / 3,0 / 75,7 / 4,1 / 80,9 / 4,5
21 / 56,0 / 3,1 / 79,8 / 4,1 / 85,4 / 4,6
22 / 59,1 / 3,1 / 83,9 / 4,1 / 90,0 / 4,6
23 / 62,2 / / 88,0 / / 94,6 /
(FIGURA OMITIDA)
35. Actividad ureásica de productos derivados de la soja
35.1 Principio. La prueba permite determinar la actividad de ureasa de los productos derivados de la soja y poner en consecuencia de manifiesto la cocción insuficiente de dichos productos.
La actividad ureásica se determina por la cantidad de nitrógeno amoniacal liberado por 1 g de producto en un minuto, a 30 ºC, a partir de una solución de urea.
35.2 Material y aparatos.
35.2.1 Aparato de valoración potenciométrica o pH-metro muy sensible (0,02 pH), con agitador magnético.
35.2.2 Baño de agua provisto de un termostato regulado a 30 ºC exactamente.
35.2.3 Tubos de ensayo de 150 x 18 mm, con tapones esmerilados.
35.3 Reactivos.
35.3.1 Acido clorhídrico 0,1N.
35.3.2 Solución de hidróxido de sodio 0,1N.
35.3.3 Solución tampón de fosfatos 0,05 M conteniendo 4,45 g de hidrógeno fosfato de sodio dihidrato (NaHPO · 2HO) y 3,40 g de dihidrógeno fosfato de potasio (KHPO) en 1.000 ml.
35.3.4. Solución tamponada de urea, preparada recientemente, conteniendo 30,0 g de urea por 1.000 ml de solución tampón; pH 6,9-7,0.
35.4 Procedimiento. Moler 10 g aproximadamente de la muestra, de forma que pase a través de un tamiz de mallas de 0,2 mm. En un tubo de ensayo (35.2.3) pesar, con precisión de 1 mg, 0,2 g de la muestra molida y añadir 10 ml de la solución (35.3.4). Tapar inmediatamente y agitar vigorosamente. Llevar el tubo al baño de agua (35.2.2) y dejarlo durante treinta minutos exactamente. Inmediatamente después, añadir 10 ml de ácido clorhídrico 0,1N (35.3.1), enfriar rápidamente a 20 ºC trasvasar cuantitativamente el contenido del tubo a un recipiente de valoración, lavando dos veces con 5 ml de agua. Valorar inmediatamente y con rapidez por medio de una solución de hidróxido de sodio 0,1N (35.3.2) por potenciómetro, utilizando electrodo de vidrio hasta pH 4,7. Efectuar una prueba en blanco, operando como se indica a continuación:
Introducir rápida y sucesivamente en un tubo (35.2.3) una alícuota de la muestra de 0,2 g, pesada con precisión de 1 mg, 10 ml de ácido clorhídrico 0,1N (35.3.1) y 10 ml de solución tamponada de urea (35.3.4). Enfriar inmediatamente el tubo en agua helada y dejarlo treinta minutos. Trasvasar a continuación, en las condiciones indicadas anteriormente, el contenido del tubo al recipiente y valorar por medio de la solución de hidróxido de sodio 0,1N (35.3.2) hasta un pH 4,7.
35.5 Cálculos. La actividad ureásica viene dada por la fórmula:
mg N a 30 ºC = 1,4 (V - V)
mg N a 30 ºC = 1,4 (V - V)
g minuto a 30 ºC = 30 x P
Siendo:
V = Volumen, en ml, de solución de hidróxido de sodio 0,1N consumidos en el análisis.
V = Volumen, en ml, de solución de hidróxido de sodio 0,1N consumidos por la prueba en blanco.
P = Peso de la muestra en g.
35.6 Observaciones.
35.6.1 El método es adecuado para una actividad ureásica que pueda alcanzar 1 mg de N/g por minuto a 30 ºC. Para productos más activos, la alícuota de la muestra puede reducirse hasta 50 mg.
35.6.2 Los productos cuyo contenido en materias grasas brutas sobrepase el 10% deben haber sido desengrasados previamente en frío.
35.7 Referencias. Primera Directiva de la Comisión de 15 de junio de 1971. (71/250/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 155, de 12 de julio de 1971.
36. Gosipol libre y total
36.1 Principio. El método permite determinar el gosipol libre, el gosipol total y las substancias de constitución químicamente parecidas derivadas del gosipol, presentes en las semillas, harinas y tortas del algodón, así como en los piensos que los contengan. El límite inferior de la determinación es de 20 mg/kg.
El gosipol se extrae en presencia de 3-amino-1-propanol, ya sea mediante una mezcla de isopropanol y de hexano para la determinación del gosipol libre, ya sea por la dimetilformamida para la determinación del gosipol total. El gosipol se transforma mediante anilina en gosipol-dianilina, cuya absorbancia se mide a 440 nm.
36.2 Material y aparatos.
36.2.1 Agitador (de vaivén). Alrededor de 35 oscilaciones por minuto.
36.2.2 Espectrofotómetro.
36.3 Reactivos.
36.3.1 Mezcla isopropanol-hexano. Mezclar 60 partes en volumen de isopropanol con 40 partes en volumen de n-hexano.
36.3.2 Disolvente A. Depositar en un matraz aforado de 1 litro, 500 ml aproximadamente de la mezcla isopropanol-hexano (36.3.1), 2 ml de 3-amino-1-propanol, 8 ml de ácido acético glacial y 50 ml de agua. Completar el volumen mediante la mezcla de isopropanol-hexano (36.3.1). Dicho reactivo es estable durante una semana.
36.3.3 Disolvente B. Depositar mediante pipeta en un matraz aforado en 100 ml, 2 ml de 3-amino-1-propanol y 10 ml de ácido acético glacial. Enfriar a la temperatura ambiente y completar al volumen mediante la N,N-dimetilformamida. Dicho reactivo es estable durante una semana.
36.3.4 Anilina. Si la absorbancia de la prueba en blanco excede de 0,022 destilar la anilina sobre polvo de cinc eliminando las fracciones primera y última del 10 por 100 del destilado. Este reactivo en frasco tapado de vidrio topacio y en el refrigerador, se conserva varios meses.
36.3.5 Solución patrón A de gosipol. Colocar en un matraz aforado de 250 ml, 27,9 mg de acetato de gosipol. Disolver y completar al volumen por el disolvente A (36.3.2). Introducir con pipeta 50 ml de dicha solución en un matraz aforado de 250 ml y completar a volumen con el disolvente A. La concentración en gosipol de dicha solución es de 0,02 mg/ml. Dejar reposar durante una hora a la temperatura ambiente, antes de su empleo.
36.3.6 Solución patrón B de gosipol. Colocar en un matraz aforado de 50 ml, 27,9 mg de acetato de gosipol. Disolver y completar a volumen mediante el disolvente B (36.3.3). La concentración en gosipol de dicha solución es de 0,5 mg/ml.
Conservadas al abrigo de la luz las soluciones patrón A y B de gosipol, se mantienen estables durante veinticuatro horas.
36.4 Procedimiento.
36.4.1 Toma de muestras. La toma de muestras está en relación con el supuesto contenido en gosipol de la muestra. Es preferible operar sobre una pequeña toma de muestras y sobre una parte alícuota del filtrado relativamente importante, de forma que se obtenga una cantidad de gosipol suficiente para efectuar una medición fotométrica precisa. Para la determinación del gosipol libre en las semillas, harinas y tortas de algodón, la toma de muestras no debe exceder de 1 g; para los piensos compuestos podrá alcanzar los 5 g. Una parte alícuota de 10 ml de filtrado es suficiente en la mayoría de los casos; deberá contener de 50 a 100 microgramos de
gosipol. Para la determinación del gosipol total, la toma de muestras podrá variar de 0,5 a 5 g con el fin de que una parte alícuota de 2 ml de filtrado contenga de 40 a 200 microgramos de gosipol.
El análisis debe efectuarse a una temperatura ambiente cercana a los 20 ºC.
36.4.2 Determinación del gosipol libre. Introducir la muestra en un matraz de boca esmerilada de 250 ml, cuyo fondo esté recubierto de perlas de vidrio. Añadir con pipeta 50 ml de disolvente A (36.3.2.), tapar el matraz y mezclar durante una hora en el agitador. Filtrar en seco y recoger el filtrado en un pequeño matraz de cuello esmerilado. A lo largo de la filtración, recubrir el embudo con un vidrio de reloj. Introducir con pipeta respectivamente en dos matraces aforados de 25 ml (A y B) unas partes alícuotas idénticas de filtrado que contengan de 50 a 100 microgramos de gosipol. Completar si fuera necesario, el volumen a 10 ml con la ayuda del disolvente A (36.3.2) completar seguidamente al volumen el contenido del matraz (A) mediante la mezcla isopropanol-hexano (36.3.1). Dicha solución se empleará como solución de referencia para la medición de la solución de la muestra.
Introducir con pipeta 10 ml del disolvente A (36.3.2) respectivamente en otros dos matraces aforados de 25 ml (C y D). Completar a volumen el contendio del matraz (C) mediante la mezcla isopropanol-hexano (36.3.1). Dicha solución se empleará como solución de referencia para la medición de la solución de la prueba en blanco.
Añadir 2 ml de anilina (36.3.4) respectivamente en los matraces (D) y (B). Calentar durante treinta minutos sobre un baño de agua hirviendo para desarrollar el color. Refrigerar a la temperatura ambiente, completar a volumen mediante la mezcla isopropanol-hexano (36.3.1), homogeneizar y dejar reposar durante una hora.
Determinar mediante el espectrofotómetro a 440 nm en cubetas de 1 cm la absorbancia de la solución de la prueba en blanco (D) en comparación con la solución de referencia (C) y la absorbancia de la solución de la muestra (B) en comparación con la solución de referencia (A).
Restar el valor de la absorbancia de la solución de la prueba en blanco de la solución de la muestra (absorbancia corregida). Calcular a partir de dicho valor el contenido en gosipol libre tal como se indica en 36.5.
36.4.3 Determinación del gosipol total. Introducir una muestra que contenga de 1 a 5 mg de gosipol en un matraz aforado de 50 ml y añadir 10 ml de disolvente B (36.3.3). Preparar simultáneamente una prueba en blanco introduciendo 10 ml de disolvente B (36.3.3) en otro matraz aforado de 50 ml. Calentar ambos matraces durante treinta minutos sobre un baño de agua hirviendo. Refrigerar a la temperatura ambiente y completar el contenido de cada matraz a volumen con la mezcla isopropanol-hexano (36.3.1). Homogeneizar y dejar reposar durante diez a quince minutos; filtrar a continuación y recoger los filtrados en matraces de boca esmerilada.
Llevar mediante pipeta 2 ml de filtrado de la muestra respectivamente a dos matraces aforados de 25 ml y 2 ml del filtrado de la prueba en blanco respectivamente a otros dos matraces de 25 ml. Tomar un matraz de cada serie y completar los contenidos respectivos a 25 ml mediante la mezcla isopropanol-hexano (36.3.1). Estas soluciones se emplearán como soluciones de referencias.
Añadir 2 ml de anilina (36.3.4) respectivamente en los otros dos matraces. Calentar durante treinta minutos en baño de agua hirviendo para desarrollar el color. Refrigerar a temperatura ambiente, completar a 25 ml mediante la mezcla de isopropanol-hexano (36.3.1), homogeneizar y dejar reposar durante una hora.
Determinar la absorbancia tal como se indica en 36.4.2 para el gosipol libre. Calcular a partir de dicho valor el contenido en gosipol total como se indica en 36.5.
36.5 Cálculos. El cálculo de los resultados puede hacerse a partir de la absorbancia específica (36.5.1) o refiriéndose a una curva de calibrado (36.5.2).
36.5.1 A partir de las absorbancias específicas. En las condiciones descritas, las absorbancias específicas son las siguientes:
Gosipol libre: E
Gosipol libre: E = 625.
Gosipol total: E
Gosipol total: E = 600.
El contenido en gosipol libre o total de la muestra está dado por la siguiente fórmula:
A · 1250
Gosipol % = A · 1250
E
E · p · a
Siendo:
A = Absorbancia corregida, determinada como se indica en 36.4.2.
p = Peso de la muestra en g.
a = Parte alícuota del filtrado en ml.
36.5.2 A partir de una curva de calibrado.
36.5.2.1 Gosipol libre. Preparar dos series de cinco matraces aforadas de 25 ml. En cada serie, introducir mediante pipeta en los matraces unos volúmenes respectivos de 2,0 - 4,0 - 6,0 - 8,0 y 10,0 ml de la solución patrón A de gosipol (36.3.5), completar a 10 ml con el disolvente A. Completar cada serie mediante un blanco constituido por un matraz aforado de 25 ml que contenga únicamente 10 ml de disolvente A (36.3.2).
Completar a 25 ml el volumen de los matraces de la primera serie (incluido el blanco) mediante la mezcla isopropanol-hexano (36.3.1) (serie de referencia).
Añadir 2 ml de anilina (36.3.4) en cada matraz de la segunda serie (incluyendo el blanco). Calentar durante treinta minutos en un baño de agua hirviendo para desarrollar el color. Refrigerar a temperatura ambiente, completar el volumen mediante la mezcla isopropanol-hexano (36.3.1), homogeneizar y dejar reposar durante una hora (serie patrón).
Determinar en las condiciones indicadas en 36.4.2 la absorbancia de las soluciones de la serie patrón en comparación con las soluciones correspondientes de la serie de referencia. Trazar gráficamente la curva de calibrado poniendo las absorbancias en relación con las cantidades de gosipol (en microgramos).
36.5.2.2. Gosipol total. Preparar seis matraces aforados de 50 ml. Introducir en el primer matraz 10 ml de disolvente B (36.3.3) y en los otros, respectivamente 2,0 - 4,0 - 6,0 - 8,0 y 10,0 ml de la solución patrón B de gosipol (36.3.5). Completar el contenido de cada matraz hasta 10 ml con la ayuda del disolvente B (36.3.3). Calentar durante treinta minutos en un baño de agua hirviendo. Refrigerar a temperatura ambiente, completar a volumen mediante la mezcla isopropanol-hexano (36.3.1) y homogeneizar.
Introducir 2,0 ml de dichas soluciones respectivamente en dos series de seis matraces aforados de 25 ml. Completar a 25 ml el contenido de los matraces de la primera serie mediante la mezcla de isopropanol-hexano (36.3.1) (serie de referencia).
Añadir 2 ml de anilina (36.3.4) en cada matraz de la segunda serie. Calentar durante treinta minutos en un baño de agua hirviendo. Refrigerar a temperatura ambiente, completar a volumen mediante la mezcla isopropanol-hexano (36.3.1), homogeneizar y dejar reposar durante una hora (serie patrón).
Determinar en las condiciones indicadas en 36.4.2 la absorbancia de las soluciones de la serie patrón en comparación con las soluciones correspondientes de la serie de referencia. Trazar gráficamente la curva de calibrado poniendo las absorbancias en relación con las cantidades de gosipol en microgramos.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre una misma muestra no debe exceder:
- Del 15 por 100, en valor relativo, para los contenidos en gosipol inferiores a 500 mg/kg.
- De 75 mg/kg en valor absoluto, para los contenidos comprendidos entre 500 y 750 mg/kg.
- Del 10 por 100, en valor relativo, para los contenidos superiores a 750 mg/kg.
36.6 Referencias. Tercera Directiva de la Comisión, de 27 de abril de 1972. (72/199/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 123, de 29 de mayo de 1972.
37. Teobromina
37.1 Principio. El método permite determinar el contenido en teobromina de los subproductos de transformación de semillas de cacao. La teobromina se extrae mediante cloroformo. El extracto se evapora a sequedad, se pone en solución acuosa y se trata con un volumen determinado de solución de nitrato de plata. El ácido nítrico liberado se titula por una solución de hidróxido de sodio.
37.2 Material y aparatos.
37.2.1 Matraces de 500 ml de fondo plano y tapón esmerilado.
37.3 Reactivos.
37.3.1 Cloroformo p.a.
37.3.2 Amoníaco, d: 0,958.
37.3.3 Sulfato de sodio p.a., anhidro.
37.3.4 Solución de hidróxido de sodio 0,1N.
37.3.5 Solución de nitrato de plata 0,1N.
37.3.6 Solución etanólica al 1 por 100 (p/v) de rojo de fenol.
37.3.7 Eter dietílico.
37.4 Procedimiento. Pesar, con precisión de 1 mg, una alícuota de 10 g como máximo, que no contenga más de 80 mg de teobromina. Introducrla en un matraz de 500 ml de fondo plano y tapón esmerilado, añadir 270 ml de cloroformo (37.3.1) y 10 ml de amoníaco (37.3.2). Tapar el matraz y agitar enérgicamente durante cinco minutos. Añadir a continuación 12 g de sulfato de sodio anhidro (37.3.3), agitar de nuevo y dejar reposar hasta el día siguiente. Filtrar en un erlenmeyer de 500 ml y lavar el residuo con 100 ml de cloroformo (37.3.1). Destilar el disolvente y eliminar los últimos restos en un baño de agua hirviendo. Recoger el extracto en 50 ml de agua y llevar a ebullición.
Refrigerar, neutralizar exactamente con la solución de hidróxido de sodio (37.3.4) en presencia de 0,5 ml de solución de rojo de fenol (37.3.6). Valorar el ácido nítrico liberado con la solución de hidróxido de sodio (37.3.4) hasta viraje del indicador (pH 7,4).
37.5 Cálculos. 1 ml de NaOH 0,1N corresponde a 18 mg de teobromina. Expresar el resultado en porcentaje de la muestra.
37.6 Observaciones. Los productos cuyo contenido en materias grasas brutas exceda de 8 por 100 deben ser previamente desgrasados por extracción durante seis horas con éter de petróleo (Eb. 40 ºC).
37.7 Referencias. Primera Directiva de la Comisión de 15 de junio de 1971. (71/250/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 155, de 12 de julio de 1971.
38. Retinol (vitamina A)
38.1 Principio. El método permite determinar el contenido en retinol (vitamina A) en piensos, concentrados y premezclas. El límite inferior de detección es de 10.000 UI/kg (1 UI igual a 0,3 microgramos de retinol) para los piensos fuertemente pigmentados y de 4.000 UI/kg para los demás productos. Los productos se clasifican según su contenido supuesto en retinol en dos grupos:
Grupo A: contenidos inferiores a 200.000 UI/kg.
Grupo B: contenidos iguales o superiores a 200.000 UI/kg.
La muestra se hidroliza en caliente mediante hidróxido de potasio en medio etanólico y en presencia de un antioxidante o en atmósfera de nitrógeno. La mezcla se somete a extracción con 1,2-dicloroetano. El extracto se evapora a sequedad y se redisuelve en éter de petróleo. La solución se cromatografía en columna de óxido de aluminio (para los productos del grupo B, la cromatografía sólo es necesaria en ciertos casos). El retinol se determina por espectrofotometría a 610 nm después de la obtención de un complejo coloreado según la reacción CarrPrice, en el caso de los productos del grupo A; por espectrofotometría U.V. a 325 nm en el caso de los productos del grupo B.
38.2 Material y aparatos.
38.2.1 Baño de agua.
38.2.2 Evaporador rotativo a vacío con matraces redondos de diferentes capacidades.
38.2.3 Columnas de vidrio para cromatografía (longitud: 300 mm; diámetro interior: 13 mm aproximadamente).
38.2.4 Espectrofotómetro con cubetas de 10 mm de espesor (de cuarzo para medidas en U.V.).
38.2.5 Lámpara U.V. de 365 nm.
38.3 Reactivos.
38.3.a) Utilizados para el análisis de los productos de los grupos A y B.
38.3.a.1 Etanol del 96 por 100 (v/v).
38.3.a.2 Solución al 10 por 100 (p/v) de ascorbato de sodio p.a. o (38.3.a.3).
38.3.a.3 Nitrógeno purificado.
38.3.a.4 Solución al 50 por 100 (p/v) de hidróxido de potasio p.a.
38.3.a.5 Solución de hidróxido de potasio 1N.
38.3.a.6 Solución de hidróxido de potasio 0,5N.
38.3.a.7 1,2-dicloroetano p.a.
38.3.a.8 Eter de petróleo, puro, intervalo de ebullición 30-50 ºC. Si es necesario, purificarlo como sigue:
Agitar 1.000 ml de éter de petróleo con porciones de 20 ml de ácido sulfúrico concentrado hasta que el ácido permanezca incoloro.
Eliminar el ácido y lavar el éter sucesivamente con 500 ml de agua, dos veces con 250 ml de una solución al 10 por 100 de hidróxido de sodio y tres veces con 500 ml de agua. Eliminar la capa acuosa, secar el éter durante una hora sobre carbón activo y sulfato de sodio anhidro, filtrar y destilar.
38.3.a.9 Oxido de aluminio estandarizado según Brockmann. Calcinar durante ocho horas a 750 ºC, enfriar en desecador y conservar en frasco de vidrio color ámbar, de tapón de rosca. Antes de utilizarlo en la cromatografía, humedecer como sigue: introducir en un matraz de vidrio color ámbar 10 g de óxido de aluminio y 0,7 ml de agua, tapar herméticamente, calentar cinco minutos en un baño de agua hirviendo agitando enérgicamente. Dejar enfriar agitando. Comprobar la actividad el óxido de aluminio así preparado, analizando según 38.4.2 y 38.4.3 una cantidad conocida de retinol patrón (38.3.b.4).
38.3.a.10 Oxido de aluminio básico, grado de actividad 1.
38.3.a.11 Eter dietílico puro. Eliminar los peróxidos y las trazas de agua por cromatografía en columna de óxido de aluminio básico (38.3.a.10) (25 g de óxido de aluminio para 250 ml de éter dietílico).
38.3.a.12. Soluciones de éter de petróleo (38.3.a.8) con 4, 8, 12, 16 y 20 por 100 (v/v) de éter dietílico.
38.3.a.13 Solución de sulfuro de sodio 0,5 M en glicerina del 70 por 100, preparada a partir de sulfuro de sodio p.a.
38.3.b) Utilizados exclusivamente para el análisis de los productos del grupo A.
38.3.b.1 Benceno p.a. cristalizable.
38.3.b.2 Cloroformo p.a. Eliminar el etanol, el fosgeno y las trazas de agua por cromatografía en columna de óxido de aluminio básico (38.3.a.10) (50 g de óxido de aluminio por cada 200 ml de cloroformo); conviene cromatografiar por segunda vez los 50 primeros ml del eluido.
38.3.b.3 Reactivo según Carr-Price. Agitar 25 g aproximadamente de tricloruro de antimonio p.a. (conservado en desecador) con 100 ml de cloroformo (38.3.b.2) hasta saturación de la solución. Un pequeño depósito de tricloruro de antimonio no altera. Añadir 2 ml de anhídrido acético p.a. Conservar en congelador en un frasco de vidrio ámbar con tapón de rosca. Este reactivo así conservado es estable durante varias semanas.
38.3.b.4 Retinol patrón controlado por espectrofotometría.
38.3.c) Utilizados exclusivamente para el análisis de los productos del grupo B.
38.3.c.1 Isopropanol para cromatografía.
38.4 Procedimiento.
38.4.1 Hidrólisis y extracción. Tomar una porción de la muestra finamente dividida, proporcional al contenido supuesto de vitamina A:
- 0,1 a 1,0 g para los concentrados (contenidos superiores a 20.000 UI/g).
- 3,0 a 5,0 g para las premezclas (contenidos comprendidos entre 400 y 20.000 UI/g).
- 10 a 20 g para las mezclas minerales.
- 30 g para los productos del grupo A.
Introducirla inmediatamente en un matraz de 500 ml de tapón esmerilado.
Añadir sucesivamente 40 ml de etanol (38.3.a.1), 2 ml de solución ascorbato de sodio (38.3.a.2) 10 ml de solución de hidróxido de potasio al 50 por 100 (38.3.a.4) y 2 ml de solución de sulfuro de sodio 0,5 M (38.3.a.13). Calentar durante treinta minutos a 70-80 ºC bajo refrigerante de reflujo y enfriar al grifo. Añadir 50 ml de etanol (38.3.a.1) y 100 ml (tomados con pipeta) de 1,2-dicloroetanol (38.3.a.7).
Agitar enérgicamente y decantar el líquido sobrenadante en embudo de decantación y añadir 150 ml de solución de hidróxido de potasio 1N (38.3.a.5), agitar durante diez segundos y dejar reposar hasta la separación de las fases. Recoger la fase inferior de dicloroetano en otro embudo de decantación, añadir 40 ml de solución de hidróxido de potasio 0,5N (38.3.a.6), agitar durante diez segundos y dejar reposar hasta la separación de las fases. Recoger la fase de dicloroetano en otro embudo de decantación y lavar seis u ocho veces con porciones de 40 ml de agua hasta la ausencia de álcali en el agua de lavado (ensayo con fenolftaleína). Recoger la fase de dicloroetano y eliminar las últimas trazas de agua mediante bandas de papel de filtro.
Evaporar a sequedad a vacío y en baño de agua a 40 ºC, una alícuota de la solución. Redisolver rápidamente el residuo con 5 ml de éter de petróleo (38.3.a.8).
Para los productos del grupo A, cromatografiar como se indica en 38.4.2.1.
Para los productos del grupo B, transferir la solución a un matraz aforado de 50 ml, completar a volumen con éter de petróleo (38.3.a.8), homogeneizar y medir la absorbancia como se indica en 38.4.3.
38.4.2 Cromatografía.
38.4.2.1 Productos del grupo A. Llenar la columna para cromatografía (38.2.3) hasta una altura de 200 mm de óxido de aluminio (38.3.a.9), previamente impregnado de éter de petróleo (38.3.a.8). Introducir en la columna la solución obtenida en 38.4.1 y añadir inmediatamente 20 ml de éter de petróleo (38.3.a.8). Eluir sucesivamente con porciones de 10 ml de las soluciones de éter de petróleo con 4, 8, 12, 16 y 20 por 100 de éter dietílico (38.3.a.12) a vacío parcial o a presión; la velocidad de elución debe ser de dos a tres gotas por segundo.
El caroteno es eluido en primer lugar. (El contenido en caroteno de esta fracción puede ser determinado por la medida de la absorbancia a 450 nm; En = 2. 600).
38.4.2.2 Productos del grupo B. La cromatografía no debe ser efectuada a menos que las medidas de la absorbancia obtenidas en 38.4.3.2 no estén conformes con las prescripciones indicadas en 38.4.3.2.
Si la cromatografía fuera necesaria, introducir en la columna cromatográfica una alícuota de la solución en éter de petróleo obtenida en 38.4.1 que contenga aproximadamente 500 UI de retinol y cromatografiar como se indica en 38.4.2.1.
38.4.3 Medida de absorbancia.
38.4.3.1 Evaporar a sequedad, a vacío, la fracción cromatográfica que contiene el retinol obtenida en 38.4.2.1. Redisolver el residuo con 2 ml de benceno (38.3.b.1). Tomar 0,3 ml de esta solución y añadir 3 ml del reactivo de Carr-Price (38.3.b.3). Se desarrolla una coloración azul. Medir la absorbancia en el espectrofotómetro a 610 nm exactamente a los treinta segundos del comienzo de la reacción.
Determinar el contenido en retinol mediante una curva patrón obtenida a partir de las soluciones bencénicas de concentraciones crecientes en retinol patrón tratadas por el reactivo de Carr-Price (de 2 a 16 UI de vitamina A patrón) (38.3.b.4) con 0,3 ml de benceno (38.3.b.1) más 3 ml del reactivo de Carr-Price (38.3.b.3).
La curva patrón debe ser comprobada regularmente y en breves intervalos de tiempo mediante una solución recientemente preparada del reactivo de Carr-Price.
38.4.3.2 Productos del grupo B. Tomar una alícuota de la solución en éter de petróleo obtenida en 38.4.1, que contenga aproximadamente 200 UI de retinol. Evaporar a sequedad en vacío y redisolver el residuo con 25 ml de isopropanol (38.3.c.1). Medir la absorbancia en el espectrofotómetro a 334, 325 y 310 nm. El máximo de absorción está situado a 325 nm. El contenido en retinol de la solución se calcula como sigue:
A x 18,30 = UI de retinol
No obstante, las relaciones entre absorbancias A/A y A/A deben ser de 6/7 = 0,857.
Si una de estas relaciones se separa sensiblemente de este valor (menor de 0,830 o mayor de 0,880), la medida de las absorbancias debe ser precedida de una cromatografía según el procedimiento indicado en 38.4.2. Si la medida de las absorbancias efectuadas después de la cromatografía indica que las relaciones antes mencionadas se separan todavía sensiblemente del valor 0,857 (menor de 0,830 o mayor de 0,880), la determinación debe ser efectuada según el procedimiento indicado para los productos del grupo A.
38.5 Cálculos. Calcular el contenido en retinol de la muestra teniendo en cuenta el peso de partida y las diluciones efectuadas a lo largo del análisis.
Expresar el resultado en UI de retinol por kg. La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe pasar de:
- 20 por 100 en valor relativo para los contenidos en retinol inferiores a 75.000 UI/kg.
- 15.000 UI para los contenidos de retinol comprendidos entre 75.000 y 150.000 UI/kg.
- 10 por 100 en valor relativo para los contenidos comprendidos entre 150.000 y 250.000 UI/kg.
- 25.000 para los contenidos comprendidos entre 250.000 y 500.000 UI/kg.
- 5 por 100 en valor relativo para los contenidos superiores a 500.000 UI/kg.
38.6 Observaciones.
38.6.1 Todas las manipulaciones deben hacerse en ausencia de luz directa y si es posible en material de vidrio de color ámbar.
38.6.2 La adición de ascorbato no es necesaria si la hidrólisis se realiza en corriente de nitrógeno (38.4.1).
38.6.3 Para los piensos de lactancia y los productos con tendencia a hincharse, doblar la cantidad de los reactivos indicados en 38.4.1, etanol (38.3.a.1), solución de ascorbato de sodio (38.3.a.2), solución de hidróxido de potasio (38.3.a.4) y solución de sulfuro de sodio (38.3.a.13).
38.6.4 Guardar las precauciones debidas a la peligrosidad de los reactivos (especialmente benceno).
38.7 Referencias. Cuarta Directiva de la Comisión de 5 de diciembre de 1972. 73/46/CEE. «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 83/21, de 30 de marzo de 1973.
39. Tiamina (aneurina, vitamina B)
39.1 Principio. La muestra se trata en caliente con ácido sulfúrico diluido y se hidroliza a continuación por vía enzimática.
La solución obtenida se somete a oxidación alcalina. El tiocromo formado se extrae con isobutanol y se determina por fluorimetría.
El método permite determinar la tiamina (aneurina, vitamina B) en piensos, concentrados y premezclas. El límite de detección es de 5 ppm.
39.2 Material y aparatos.
39.2.1 Baño de agua.
39.2.2 Centrífuga (3.500 rpm) con tubos de 30 a 50 ml, provistos de tapón de rosca.
39.2.3 Fluorímetro.
39.3 Reactivos.
39.3.1 Solución patrón de tiamina de 100 microgramos/ml.
Disolver 112,3 mg de clorhidrato de tiamina, calidad patrón, previamente desecado a vacío hasta peso constante, en 1.000 ml de ácido sulfúrico 0,2N (39.3.2). En frío y en oscuridad esta solución es estable durante un mes.
39.3.2 Acido sulfúrico 0,2N.
39.3.3 Metabisulfito de sodio, NaSO puro.
39.3.4 Solución al 20 por 100 (p/v) de hexacianoferrato (III) de potasio p.a.
39.3.5 Solución al 25 por 100 (p/v) de hidróxido de potasio p.a.
39.3.6 Mezcla oxidante: mezclar 2 ml de solución de hexacianoferrato (III) de potasio (39.3.4) con 48 ml de solución de hidróxido de potasio (39.3.5). Esta mezcla no se conserva más de cuatro horas.
39.3.7 Isobutanol p.a.
39.3.8 Solución de acetato de sodio 2,5N.
39.3.9 Preparación multienzimática conteniendo proteasa, fosfatasa y amilasa (por ejemplo clarasa).
39.3.10 Etanol del 96 por 100 (v/v).
39.4 Procedimiento.
39.4.1 Hidrólisis enzimática. Introducir en dos matraces aforados A y B de 250 ml, cantidades idénticas de muestra finamente molida, conteniendo 100 microgramos de tiamina y 125 ml de ácido sulfúrico (39.3.2). Añadir solamente al matraz A 1,0 ml de solución patrón (39.3.1) (patrón interno).
Agitar vigorosamente, llevar los matraces a un baño de agua hirviendo y mantenerlos durante quince minutos agitando de vez en cuando. Dejar enfriar hasta 45 ºC aproximadamente. Añadir a cada matraz 20 ml de solución de acetato de sodio (39.3.8) y 0,5 g de preparación multienzimática (39.3.9), dejar reposar a continuación durante veinte minutos a temperatura ambiente. Añadir 20 ml de solución de acetato de sodio y completar a volumen con agua, homogeneizar y filtrar. Recoger los filtrados A y B después de haber eliminado los 15 primeros ml. Preparar las soluciones siguientes:
39.4.1.1 Solución testigo T. Introducir en un tubo de centrifuga (39.2.2), 5 ml del filtrado A y 10 mg aproximadamente de metabisulfito de sodio (39.3.3). Sumergir el tubo durante quince minutos en un baño de agua hirviendo y dejar enfriar a continuación hasta temperatura ambiente.
39.4.1.2 Solución A (patrón interno) y B (muestra). Introducir 5 ml de filtrado A en un tubo de centrífuga (39.2.2) y 5 ml del filtrado B en otro tubo de centrífuga (39.2.2).
39.4.2 Oxidación. Añadir a las soluciones T, A y B, 5 ml de la mezcla oxidante (39.3.6) y después de un minuto, 10 ml de isobutanol (39.3.7). Tapar los tubos y agitar vigorosamente durante cinco segundos. Dejar reposar durante un minuto y centrifugar para separar las fases. Tomar, de cada tubo, 5 ml de la fase isobutanólica sobrenadante, introducirlos respectivamente en los matraces aforados de 25 ml, completar a volumen con etanol (39.3.10) y homogeneizar. Esto da lugar a los extractos T, A y B.
39.4.3 Medida de la fluorescencia. Efectuar las medidas a la longitud de onda a la cual el fluorímetro da una respuesta óptima para la fluorescencia del tiocromo. Irradiar a 365 nm aproximadamente.
Ajustar el instrumento a cero con el extracto T. Medir la intensidad de fluorescencia de los extractos A y B.
39.5 Cálculos. El contenido en microgramos de tiamina por kg de muestra viene dado por la fórmula:
d x b
(a - b) x c
Siendo:
a = Intensidad de la fluorescencia del extracto A (patrón interno).
b = Intensidad de la fluorescencia del extracto B (muestra).
c = Peso, en gramos, de la muestra.
d = Cantidad de tiamina en microgramos añadida a la muestra (patrón interno).
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe ser superior a:
- 10 por 100 en valor relativo para los contenidos inferiores a 500 ppm y
- 5 por 100 en valor relativo para los contenidos iguales o superiores a 500 ppm.
39.6 Referencias. Cuarta Directiva de la Comisión de 5 de diciembre de 1972. 73/46/CEE. «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 83/21, de 30 de marzo de 1973.
40. Acido ascórbico y ácido dehidroascórbico
(vitamina C)
40.1 Principio. El método permite determinar la suma de los ácido ascórbico y dehidroascórbico (vitamina C) en piensos, concentrados y premezclas. El límite de detección es de 5 ppm. Los productos son clasificados en dos grupos según su contenido supuesto en vitamina C:
Grupo A: Contenidos inferiores a 10 g/kg.
Grupo B: Contenidos iguales o superiores a 10 g/kg.
La muestra, puesta en suspensión en una solución diluida de ácido metafosfórico, se somete a extracción con cloroformo. La fase acuosa se trata con una solución de 2,6-diclorofenol-indofenol para transformar el ácido ascórbico en ácido dehidroascórbico, y a continuación por una solución de 2,4-dinitrofenilhidrazina. La hidrazona formada se extrae mediante una mezcla de acetato de etilo, ácido acético glacial y acetona. La solución se cromatografía en columna de gel de sílice, el eluido se evapora a sequedad y el residuo se disuelve en ácido sulfúrico diluido. La absorbancia de la solución se mide en el espectrofotómetro a 509 nm.
Para los productos del grupo A, el eluido procedente de la cromatografía en columna se somete a una cromatografía en capa fina para aislar la hidrazona.
40.2 Material y aparatos.
40.2.1 Baño de agua regulado a la temperatura de 20 ºC mediante termostato.
40.2.2 Centrífuga (3.500 r.p.m.) con tubos de 40 a 50 ml provistos de tapones de rosca.
40.2.3 Evaporador rotatorio a vacío con matraces de 250 ml.
40.2.4 Columnas de vidrio para cromatografía (longitud: 100 mm diámetro interior: 20 mm) con placa de vidrio fritado (por ejemplo tubos de Allihn).
40.2.5 Espectrofotómetro o colorímetro de filtros con cubetas de 10 mm de espesor.
40.2.6 Material para cromatografía en capa fina con placas de gel de sílice H (40.3.12), espesor de capa: 0,5 a 0,6 mm. Secar las placas de dos horas treinta minutos a tres horas en estufa a 120-130 ºC. Dejar enfriar y conservar en desecador durante veinticuatro horas antes de su empleo.
40.2.7 Estufa regulada a 120-130 ºC.
40.3 Reactivos.
40.3.1 Solución patrón del 0,05 por 100 de ácido L-ascórbico: disolver 50 mg de ácido L-ascórbico p.a. en 20 ml aproximadamente de ácido metafosfórico (40.3.2) y completar a 100 ml con agua. Preparar inmediatamente antes de su empleo.
40.3.2 Solución al 10 por 100 de ácido metafosfórico: disolver en agua 200 g de ácido metafosfórico p.a. triturados en mortero, y completar a 2.000 ml con agua. Conservar a 4 ºC. Renovar al cabo de una semana.
40.3.3 Cloroformo p.a.
40.3.4 Solución al 0,5 por 100 (p/v) de 2,6-diclorofenol-indofenol p.a. Preparar inmediatamente antes de su empleo.
40.3.5 Auxiliar de filtración (S y S número 121 o equivalente).
40.3.6 Solución ácida al 2 por 100 (p/v) de 2,4-dinitrofenilhidrazina: disolver 2 g de de 2,4-dinitrofenilhidrazina en 100 ml de ácido sulfúrico diluido (25 ml de ácido sulfúrico p.a. d = 1,84, diluidos hasta 100 ml con agua). En frío esta solución se conserva durante una semana.
40.3.7 Nitrógeno o (40.3.8).
40.3.8 Anhídrido carbónico.
40.3.9 Mezcla de acetato de etilo p.a./ácido acético glacial/acetona p.a.: 96/2/2 en volumen.
40.3.10 Mezcla de diclorometanol p.a./ácido acético glacial: 97/3 en volumen.
40.3.11 Gel de sílice, granulometría: 0,05 a 0,2 mm.
40.3.12 Gel de sílice H según Stahl, para cromatografía en capa fina.
40.3.13 Acido sulfúrico diluido: introducir 105 ml de agua en un matraz aforado de 200 ml, completar a volumen con ácido sulfúrico p.a., d = 1,84.
40.3.14 Disolvente de elución para la cromatografía en capa fina: Mezclar 75 ml de éter dietílico p.a., 25 ml de acetato de etilo p.a., y 4,0 ml de ácido acético del 96 por 100 p/v, p.a. Renovar después de dos o tres cromatografías.
40.4 Procedimiento.
40.4.1. Extracción. Introducir en dos matraces aforados A y B, de 250 ml, cantidades idénticas de la muestra finamente molida, que contengan 200 microgramos aproximadamente de vitamina C. Añadir solamente al matraz A, 0,4 ml de solución patrón (40.3.1) y homogeneizar agitando suavemente (patrón interno). Añadir a cada matraz 30 ml de cloroformo (40.3.3) y 25 ml de solución de ácido metafosfórico (40.3.2) a 4 ºC. Agitar ligeramente y dejar reposar de diez a quince minutos. Añadir 25 ml de agua, tapar los matraces, agitar vigorosamente durante diez segundos y dejar reposar de diez a quince minutos en baño de agua (40.2.1). Centrifugar para separar la fase acuosa de la fase clorofórmica. Realizar las operaciones siguientes simultáneamente sobre los extractos acuosos A (patrón interno) y B.
40.4.2 Oxidación. Tomar mediante pipeta 40 ml de la solución acuosa sobrenadante (ligeramente turbia) obtenida en (40.4.1), introducirla en un tubo de reacción de tapón de rosca, añadir de 0,5 a 1 ml de solución de 2,6-diclorofenol-indofenol (40.3.4) y homogeneizar. Se forma una coloración que debe persistir quince minutos al menos. Añadir a continuación 300 mg aproximadamente de auxiliar de filtración (40.3.5), agitar y filtrar sobre un filtro de pliegues seco. El filtrado no debe ser necesariamente transparente.
40.4.3 Reacción con la 2,4-dinitrofenilhidrazina y extracción de la hidrazona. Tomar mediante pipeta 10 ml del filtrado obtenido en (40.4.2), introducirlos en un tubo de centrífuga (40.2.2), añadir 2 ml de solución de 2,4-dinitrofenil-hidrazina (40.3.6) y homogeneizar. Hacer pasar rápidamente por el tubo una corriente de nitrógeno (40.3.7) o de anhídrido carbónico (40.3.8), tapar el tubo y sumergirlo durante quince horas aproximadamente (una noche) en el baño de agua (40.2.1). Añadir a continuación 3 ml de agua, 20 ml de la mezcla de acetato de etilo/ácido acético glacial/acetona (40.3.9) y 800 mg aproximadamente de auxiliar de filtración (40.3.5). Tapar el tubo, agitar vigorosamente durante treinta segundos y centrifugar. Introducir 15 ml de la fase sobrenadante en un matraz de evaporación y evaporar a presión reducida en el evaporador rotativo (40.2.3) hasta la obtención de un residuo oleoso. Disolver el residuo en 2 ml de la mezcla de acetato de etilo/ácido acético glacial/acetona (40.3.9) calentando a 50 ºC, dejar enfriar, añadir 10 ml de la mezcla diclorometano/ácido acético glacial (40.3.10) homogeneizar.
40.4.4 Cromatografía en columna. Llenar la columna cromatográfica (40.2.4) hasta una altura de 30 mm con la mezcla diclorometano/ácido acético glacial (40.3.10). Poner en suspensión (agitando vigorosamente) 5 g de gel de sílice (40.3.11) en 30 ml de la mezcla diclorometano/ácido acético glacial (40.3.10) y verter la suspensión en la columna. Dejar depositar y comprimir bajo débil presión de nitrógeno (40.3.7).
Trasvasar a la columna cromatográfica la solución obtenida en 40.4.3, lavar el matraz con una pequeña cantidad de mezcla diclorometano/ácido acético glacial (40.3.10) y trasvasar a la columna, llenar con la mezcla (40.3.10) y continuar el lavado de la columna con la misma mezcla (3 ó 4 porciones de 5 ml aproximadamente), hasta la obtención de un eluido incoloro. Eliminar la fracción eluida coloreada de amarillo.
Eluir la zona rojiza en la cabeza de la columna mediante la mezcla acetato de etilo/ácido acético glacial/acetona (40.3.9), recoger el eluido y evaporar a sequedad.
40.4.4.1 Para los productos del grupo A (contenidos en vitamina C inferiores a 10 g/kg), disolver el residuo en 2,0 ml de la mezcla acetato de etilo/ácido acético glacial/acetona (40.3.9) y proceder inmediatamente a la cromatografía en capa fina como se indica en 40.4.5.
40.4.4.2 Para los productos del grupo B (contenidos en vitamina C iguales o superiores a 10 g/kg), redisolver el residuo oleoso en 4,0 ml de ácido sulfúrico diluido (40.3.13), agitar vigorosamente para disolver completamente el residuo y proceder a la medida de la absorbancia como se indica en 40.4.6.
40.4.5 Cromatografía en capa fina. Efectuar las operaciones indicadas a partir de aquí por duplicado.
Depositar en forma de banda sobre la placa de cromatografía en capa fina (40.2.6) 0,5 ml de la solución obtenida en 40.4.4.1. Desarrollar durante veinte minutos por lo menos mediante el eluyente (40.3.14) en cámara saturada hasta separación clara de la zona de la hidrazona, coloreada de rosa. Dejar secar al aire. Delimitar la zona rosa, rasparla con una espátula y transferir cuantitativamente la masa pulverulenta a una columna de cromatografía (40.2.4).
Eluir sucesivamente una vez con 2 ml y dos veces con 1,5 ml de la mezcla acetato de etilo/ácido acético glacial/acetona (40.3.9). Recoger el eluido en un matraz pequeño (la última fracción debe ser incolora). Evaporar a sequedad, redisolver el residuo oleoso en 4,0 ml de ácido sulfúrico diluido (40.3.13), agitar vigorosamente para disolver completamente el residuo y proceder a la medida de la absorbancia.
40.4.6 Medida de la absorbancia. Medir la absorbancia en un espectrofotómetro a 509 nm de veinte a treinta minutos desde la puesta en disolución del residuo en ácido sulfúrico diluido (40.3.13).
Efectuar las medidas por comparación con ácido sulfúrico diluido (40.3.13).
40.4.7 Prueba en blanco.
Efectuar paralelamente un ensayo en blanco aplicando el mismo método operativo.
40.5 Cálculos. El contenido en g de vitamina C por kg de muestra viene dado por la fórmula:
(c - a) x 2
(b - c) x 10 d
Siendo:
a = Absorbancia del blanco.
b = Absorbancia de la solución de patrón interno.
c = Absorbancia de la solución de muestra.
d = Peso, en g, de la muestra.
La diferencia ente los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe pasar del 10 por 100 en valor relativo para los contenidos en vitamina C inferiores a 10 g/kg y de 5 por 100 en valor relativo para los contenidos iguales o superiores a 10 g/kg.
40.6 Referencias. Cuarta Directiva de la Comisión de 5 de diciembre de 1972. (73/46/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 83/21, de 30 de marzo de 1973.
41. Menadiona (vitamina K)
41.1 Principio. La muestra se somete a extracción mediante etanol diluido. La mezcla se defeca con solución de tanino y se centrifuga. El extracto se trata con solución de carbonato de sodio. La menadiona liberada se extrae con 1,2-dicloroetano. El extracto en dicloroetano se trata, según su contenido en menadiona, directamente o previa evaporación, con 2,4-dinitro-fenilhidrazina en solución en etanol acidificado por ácido clorhídrico. La hidrazona obtenida da lugar, al añadirle un exceso de amoniaco, a un complejo de color azul-verdoso cuya absorbancia se mide a 635 nm. El método permite determinar la menadiona (vitamina K) en piensos, concentrados y premezclas. El límite inferior de detección es de 1 ppm.
41.2 Material y aparatos.
41.2.1 Agitador mecánico.
41.2.2 Centrífuga (3.000 a 5.000 rpm).
41.2.3 Embudos de decantación de 100 y 250 ml, con tapón esmerilado.
41.2.4 Evaporador rotativo a vacío con matraces de 250 ml.
41.2.5 Baño de agua.
41.2.6 Espectrofotómetro con cubetas de 10 mm de espesor.
41.3 Reactivos.
41.3.1 Etanol al 96 por 100 (v/v).
41.3.2 Etanol (41.3.1) diluido al 40 por 100 con agua.
41.3.3 Solución al 10 por 100 (p/v) de tanino, obtenida a partir de tanino puro en polvo.
41.3.4 1,2, dicloroetano p.a.
41.3.5 Solución al 10 por 100 (p/v) de carbonato de sodio anhidro p.a.
41.3.6 Acido clorhídrico al 37 por 100 (p/p), de = 1,19.
41.3.7 Etanol absoluto.
41.3.8 Reactivo de 2,4-dinotrofenilhidrazina: disolver 40 mg de 2,4-dinitrofenilhidrazina p.a. en 40 ml aproximadamente de etanol absoluto (41.3.7) hirviendo. Dejar enfriar y trasvasar a un matraz aforado de 50 ml. Añadir 1 ml de ácido clorhídrico (41.3.6) y completar a volumen con etanol absoluto (41.3.7). Preparar inmediatamente antes de su empleo.
41.3.9 Hidróxido de amonio al 25 por 100 (p/p), d = 0,91.
41.3.10 Solución amoniacal de etanol: mezclar un volumen de etanol (41.3.7) y un volumen de hidróxido de amonio (41.3.9).
41.3.11 Soluciones patrón de menadiona: disolver 20 mg de menadiona (vitamina K) en el 1,2-dicloroetano (41.3.4) y completar a 200 ml. Diluir partes alícuotas de esta solución mediante el 1,2-dicloroetano (41.3.4) para obtener una serie de soluciones patrón cuyas concentraciones en menadiona estén comprendidas entre 2 y 10 microgramos por mililitro. Preparar inmediatamente antes de su empleo.
41.4 Procedimiento.
41.4.1 Extracción. Tomar una porción de muestra finamente molida y proporcional al contenido supuesto de menadiona:
- de 0,1 a 5,0 g para los concentrados y premezclas.
- de 20 a 30 g para los piensos.
Introducirla inmediatamente en un matraz de 250 ml con tapón esmerilado. Añadir 96 ml exactamente de etanol diluido (41.3.2) y agitar mecánicamente durante quince minutos a la temperatura ambiente. Añadir 4,0 ml de solución de tanino (41.3.3), mezclar, trasvasar el extracto a un tubo de centrífuga, centrifugar (3.000 a 5.000 rpm) y decantar.
Introducir 20 a 40 ml exactamente medidos del extracto en un embudo de decantación de 250 ml, añadir mediante pipeta 50 ml de 1,2-dicloroetano (41.3.4), mezclar y añadir mediante pipeta 20 ml de solución de carbonato de sodio (41.3.5). Agitar enérgicamente durante treinta segundos y recoger a continuación la fase de dicloroetano en un embudo de decantación de 100 ml. Añadir 20 ml de agua, agitar durante quince segundos, recoger la fase del dicloroetano y eliminar las trazas de agua mediante tiras de papel de filtro.
Para concentrados y premezclas, tomar una alícuota de extracto y diluir con 1,2-dicloroetano (41.3.4) para obtener una concentración en menadiona de 2 a 10 microgramos por mililitro. Para los piensos, evaporar a sequedad a 40 ºC, bajo presión reducida y en atmósfera de nitrógeno, una alícuota del extracto. Redisolver el residuo en la cantidad adecuada de 1,2-dicloroetano (41.3.4) para obtener una solución que contenga de 2 a 10 microgramos de menadiona por ml.
41.4.2 Formación de la hidrazona. Llevar 2,0 ml del extracto en dicloroetano obtenido en 41.4.1 a un matraz aforado de 10 ml y añadir 3,0 ml del reactivo de 2,4-dinitrofenilhidrazina (41.3.8). Tapar el matraz herméticamente de forma que se evite toda evaporación y calentar durante dos horas a 70 ºC sobre baño de agua. Dejar enfriar, añadir 3,0 ml de solución amoniacal de etanol (41.3.10), mezclar, completar a volumen con etanol absoluto (41.3.7) y mezclar de nuevo.
41.4.3 Medida de la absorbancia. Medir la absorbancia del complejo coloreado azul verdoso en espectrofotómetro a 635 nm por comparación con un blanco de reactivos obtenido tratando 2,0 ml de 1,2-dicloroetano (41.3.4) como se indica en 41.4.2. Determinar la cantidad de menadiona mediante la curva de calibrado establecida para cada serie de análisis.
41.4.4 Curva de calibrado. Tratar 2,0 ml de cada solución patrón de menadiona (41.3.11) como se indica en 41.4.2. Medir la absorbancia como se indica en 41.4.3. Trazar la curva de calibrado llevando a ordenadas los valores de la absorbancia y en abcisas las cantidades correspondientes de menadiona en microgramos.
41.5 Cálculos. Calcular el contenido en menadiona de la muestra teniendo en cuenta el peso de la muestra y las diluciones efectuadas en el curso del análisis. Expresar el resultado en mg de menadiona por kg.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe pasar de:
- 20 por 100 en valor relativo para los contenidos en menadiona inferiores a 10 mg/kg.
- 2 mg en valor absoluto para los contenidos en menadiona comprendidos entre 10 y 14 mg/kg.
- 15 por 100 en valor relativo para los contenidos comprendidos entre 14 y 100 mg/kg.
- 15 mg/kg en valor absoluto para los contenidos comprendidos entre 100 y 150 mg/kg.
- 10 por 100 en valor relativo para los contenidos superiores a 150 mg/kg.
41.6 Observaciones. Todas las manipulaciones deben hacerse en ausencia de luz directa y si es posible en material de vidrio color ámbar.
41.7 Referencias. Quinta Directiva de la Comisión de 25 de marzo de 1974. 74/203/CEE. «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número 108/7, de 22 de abril de 1974.
42. Virginiamicina
(por difusión en agar)
42.1 Principio. El método permite determinar la virginiamicina en piensos y en las premezclas. El límite inferior de la determinación es de 2 mg/kg. 1 mg de virginiamicina equivale a 1.000 unidades UK.
Se somete la muestra a extracción mediante solución metanólica de Tween 80. El extracto se decanta o centrifuga, y se diluye después. Su actividad antibiótica se determina por medición de la difusión de la virginiamicina en un medio de agar sembrado con Micrococus luteus. La difusión se manifiesta por la formación de zonas de inhibición de microorganismo. El diámetro de dichas zonas se considera directamente proporcional al logaritmo de la concentración de antibiótico para la gama de concentraciones utilizadas.
42.2 Reactivos.
42.2.1 Microorganismo: «Micrococus luteus» ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553).
42.2.1.1 Mantenimiento de la cepa.-Sembrar el medio de cultivo (42.2.2.1) en tubos inclinados, con Micrococus luteus. Incubar durante veinticuatro horas a 30 ºC, conservar en frigorífico a unos 4 ºC y renovar la siembra cada quince días.
42.2.1.2 Preparación de la suspensión bacteriana. Recoger los gérmenes de un tubo de agar (42.2.1.1) de preparación reciente, con ayuda de 2 a 3 ml de solución de cloruro de sodio (42.2.2.3). Sembrar con esta suspensión 250 ml del medio de cultivo (42.2.2.1) en un frasco de Roux e incubar durante dieciocho a veinte horas a 30 ºC. Recoger los gérmenes en 25 ml de solución de cloruro de sodio (42.2.2.3) y homogeneizar.
Diluir la suspensión al 1/10 con ayuda de la solución de cloruro de sodio (42.2.2.3). La transmisión luminosa de la suspensión, medida a 650 nm bajo un espesor de 1 cm, por comparación con la solución de cloruro de sodio (42.2.2.3), debe ser de alrededor del 75 por 100. Esta suspensión puede conservarse una semana a unos 4 ºC. Pueden utilizarse otros métodos, siempre que esté demostrado que producen suspensiones bacterianas análogas.
42.2.2 Medios de cultivo y reactivos.
42.2.2.1 Medio de mantenimiento de la cepa y de base para la determinación. Puede utilizarse cualquier medio de cultivo comercial de composición análoga y que dé los mismos resultados:
Peptona de carne: 6,0 g.
Triptona: 4,0 g.
Extracto de levadura: 3,0 g.
Extracto de carne: 1,5 g.
Glucosa: 1,0 g.
Agar: 10,0 a 20,0 g.
Agua 1.000 ml.
pH: 6,5 (tras esterilización).
42.2.2.2 Tampón fosfato pH 6:
Hidrogenofosfato de potasio KHPO: 2 g.
Dihidrógeno fosfato de potasio KHPO: 8 g.
Agua hasta 1.000 ml.
42.2.2.3 Solución al 0,8 por 100 (p/v) de cloruro de sodio:
Disolver en agua 8 g de cloruro de sodio, diluir hasta 1.000 ml y esterilizar.
42.2.2.4 Metanol.
42.2.2.5 Mezcla de tampón fosfato (42.2.2.2) y de metanol (42.2.2.4): 80/20 (v/v).
42.2.2.6 Solución en metanol al 0,5 por 100 (p/v) de Tween 80: disolver 5 g de Tween 80 en metanol (42.2.2.4) y diluir hasta 1.000 ml con metanol.
42.2.2.7 Sustancia de referencia: virginiamicina de actividad conocida.
42.3 Procedimiento.
42.3.1 Soluciones de referencia. Disolver una cantidad pesada exactamente de la sustancia de referencia (42.2.2.7) en metanol (42.2.2.4) y diluir con metanol (42.2.2.4) para obtener una solución madre de 1.000 microgramos de virginiamicina/ml. Conservada en frasco tapado, a 4 ºC, esta solución es estable durante cinco días. Preparar a partir de esta solución y mediante diluciones sucesivas con la mezcla (42.2.2.5), las soluciones siguientes:
S: 1 microgramo/ml.
S: 0,5 microgramo/ml.
S: 0,25 microgramo/ml.
S: 0,125 microgramo/ml.
42.3.2 Preparación del extracto y de las soluciones.
42.3.2.1 Extracción.
42.3.2.1.1 Productos cuyo contenido en virginiamicina no excede de 100 mg/kg. Pesar una cantidad de muestra de 50 g. Añadir 200 ml de solución (42.2.2.6), agitar durante treinta minutos y dejar luego sedimentar o centrifugar. Recoger 20 ml de la solución sobrenadante y evaporar hasta 5 ml en un evaporador rotativo a una temperatura que no exceda de 40 ºC. Disolver el residuo con ayuda de la mezcla (42.2.2.5) para obtener una concentración supuesta de virginiamicina de 1 microgramo/ml (= U).
42.3.2.1.2 Productos cuyo contenido en virginiamicina es superior a 100 mg/kg. Pesar una cantidad de muestra que no exceda de 10,0 g y que contenga de 1 a 50 mg de virginiamicina. Añadir 100 ml de solución (42.2.2.6), agitar durante treinta minutos, y dejar sedimentar luego o centrifugar. Diluir la solución sobrenadante con ayuda de la mezcla (42.2.2.5) para obtener una concentración de virginiamicina de 1 microgramo/ml (= U).
42.3.2.2 Soluciones del extracto. Preparar, a partir de la solución U8 y por diluciones sucesivas (1 + 1) con ayuda de la mezcla (42.2.2.5), las soluciones U (concentración supuesta = 0,5 microgramo/ml), U (concentración supuesta = 0,25 microgramo/ml) y U (concentración supuesta = 0,125 microgramo/ml).
42.3.3 Modalidades de la determinación.
42.3.3.1 Inoculación del medio de cultivo. Sembrar a unos 50 ºC el medio de base de la determinación (42.2.2.1) con la suspensión bacteriana (42.2.1.2). Mediante ensayos preliminares sobre placas con el medio (42.2.2.1), determinar la cantidad de suspensión bacteriana que permite obtener para las diferentes concentraciones de virginiamicina zonas inhibición lo mas amplias posibles sin dejar de ser nítidas.
42.3.3.2 Preparación de las cajas. La difusión en agar se efectúa en cajas con las cuatro concentraciones de la solución de referencia (S, S, S y S) y las cuatro concentraciones del extracto (U, U, U y U). Cada caja debe recibir necesariamente las cuatro concentraciones de referencia y del extracto. A tal fin, hay que elegir las dimensiones de las cajas de forma que se puedan excavar en el medio de agar por lo menos 8 cavidades de 10 a 13 mm de diámetro, cuyos centros no disten menos de 30 mm. Pueden emplearse como cajas placas de vidrio planas, coronadas por un anillo de aluminio o de materia plástica de 200 mm de diámetro y 20 mm de altura.
Introducir en las cajas una cantidad del medio (42.2.2.1), sembrado tal como se indica en (42.3.3.1), que permita obtener una capa de unos 2 mm de grosor (60 ml para una caja de 200 mm de diámetro). Dejar solidificar, excavar las cavidades y depositar en ellas volúmenes exactamente medidos de las soluciones de referencia y del extracto (0,10 a 0,15 ml por cavidad según diámetro). Repetir por lo menos 4 veces cada concentración, de forma que cada determinación comprenda la valoración de 32 zonas de inhibición.
42.3.3.3 Incubación. Incubar las cajas durante dieciséis a dieciocho horas a 30 ºC ± 2 ºC.
42.4 Cálculos. Medir el diámetro de las zonas de inhibición con un error no superior a 0,1 mm. Para cada concentración, registrar las medidas medias en papel semilogarítmico, trasladando el logaritmo de las concentraciones en relación con los diámetros de las zonas de inhibición. Trazar las rectas más ajustadas para la solución de referencia y para el extracto, por ejemplo, mediante el procedimiento siguiente:
Determinar el punto más apropiado del nivel más bajo de la solución de referencia (SL) con ayuda de la fórmula:
7S + 4S + S - 2S
(a) SL = ---------------
10
Determinar el punto más apropiado del nivel más alto de la solución de referencia (SH) con ayuda de la fórmula:
7S + 4S + S - 2S
(a) SL = ---------------
10
Determinar del mismo modo los puntos más apropiados del extracto para el nivel más bajo (UL) y el nivel más alto (UH) sustituyendo S, S, S y S en las fórmulas anteriores por U, U, U y U.
Consignar los valores SL y SH en la misma gráfica. Al unir los dos puntos, se obtiene la recta más ajustada para la solución de referencia. Se sigue el mismo método para UL y UH, y se obtiene la recta más ajustada para el extracto.
Si no hubiere ninguna interferencia, las rectas se consideran paralelas cuando (SH-SL) y (UH-UL) no difieren en más de un 10 por 100 de su media.
Si las rectas no son paralelas, pueden eliminarse U y S o U y S. Los valores SL, SH, UL y UH que permiten obtener las rectas más ajustadas se calculan entonces con ayuda de las fórmulas siguientes:
5S + 2S - S 5S + 2S - S
(a) SL = ----------- o -----------
6 6
5S + 2S - S 5S + 2S - S
(b) SH = ----------- o -----------
6 6
y de fórmulas análogas para UL y UH. La utilización de esta alternativa obliga a respetar los mismos criterios de paralelismo.
En el boletín analítico debe mencionarse la obtención de un resultado procedente de tres niveles.
Cuando las rectas se consideren paralelas, hay que
calcular el logaritmo de la actividad relativa (log A), mediante una de las fórmulas siguientes, según el número de niveles (4 ó 3) utilizados para la valoración del paralelismo.
Para 4 niveles:
(c) log A = (U + U + U + U - S - S - S - S) x 0,602
U + U + S + S - U - U - S - S
Para 3 niveles:
(d) log A = (U + U + U - S - S - S) x 0,401
U + S - U - S
(d) log A = (U + U + U - S - S - S) x 0,401
U + S - U - S
Actividad del extracto de la muestra = actividad de la referencia correspondiente A, es decir = S x A.
Si la actividad relativa no se encuentra en la gama de valores comprendidos entre 0,5 y 2,0, ha de repetirse la determinación procediendo a los ajustes apropiados de las concentraciones del extracto o, en su caso, de las soluciones de referencia. Cuando esta actividad no pueda encuadrarse en la gama de los valores exigidos, el resultado se considerará aproximado y así se hará constar en el boletín de análisis.
Cuando las rectas no se consideren paralelas, se repetirá la determinación. Si tampoco ahora se logra el paralelismo, la determinación se considerará insatisfactoria.
Expresar el resultado en miligramos de virginiamicina por kilogramo de pienso.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas con las misma muestra por el mismo analista no deben exceder de:
2 mg/kg, en valor absoluto, para los contenidos de virginiamicina inferiores a 10 mg/kg.
20 por 100 del resultado más alto, para los contenidos de 10 a 25 mg/kg.
5 mg/kg, en valor absoluto, para los contenidos de 25 a 50 mg/kg.
10 por 100 del resultado más alto, para los contenidos superiores a 50 mg/kg.
42.5 Referencias.
Directiva de la Comisión de 20 de diciembre de 1983, que modifica las Directivas 71/393, 72/199 y 78/633, (84/4/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» de 18 de enero de 1984, número L 15/28, anexo II.
43. Bacitracina-cinc
(Por difusión en agar)
43.1 Principio. El método permite determinar la bacitracina-cinc en los piensos y premezclas. El límite inferior de la determinación es de 5 mg/kg. 1 mg de bacitracina-cinc (calidad para piensos) equivale a 42 unidades internacionales (UI).
Se extrae la muestra a pH 2 mediante una mezcla de etanol, agua y ácido clorhídrico y una solución de sulfuro de sodio. El sulfuro de sodio permite precipitar las sales de cobre solubles que pudieran obstaculizar la determinación. El extracto, llevado a pH 6,5 se concentra (en caso necesario) y diluye. Su actividad antibiótica se determina por medio de la difusión de la bacitracina-cinc en un medio de agar, sembrado con Micrococus luteus (flavus). La difusión se manifiesta mediante formación de zonas de inhibición del microorganismo. El diámetro de dichas zonas se considera proporcional directamente al logaritmo de la concentración de antibiótico para la gama de concentraciones utilizadas.
43.2 Reactivos.
43.2.1 Microorganismo: Micrococcus luteus (flavus) ATCC 10240.
43.2.1.1 Mantenimiento de la cepa.
Sembrar el medio de cultivo (43.2.2.1) en tubos inclinados, con Micrococcus luteus (flavus). Incubar durante veinticuatro horas a 30 ºC, conservar en frigorífico a unos 4 ºC y renovar la siembra cada quince días.
43.2.1.2 Preparación de la suspensión bacteriana. Recoger los gérmenes de un tubo de agar (43.2.1.1) de preparación reciente con la ayuda de 2 a 3 ml de la solución de cloruro de sodio (43.2.2.3). Sembrar con esta suspensión 250 ml del medio de cultivo (43.2.2.1) en un frasco de Roux e incubar durante dieciocho a veinte horas a 30 ºC. Recoger los gérmenes en 25 ml de solución de cloruro de sodio (43.2.2.3) y homogeneizar.
Diluir la suspensión al 1/10 con ayuda de la solución de cloruro de sodio (43.2.2.3). La transmisión luminosa de la solución, medida a 650 nm bajo un espesor de 1 cm por comparación con la solución de cloruro de sodio (43.2.2.3), debe ser alrededor del 75 por 100. Esta suspensión puede conservarse una semana a unos 4 ºC. Pueden utilizarse otros métodos siempre que esté demostrado que producen suspensiones bacterianas análogas.
43.2.2. Medios de cultivo y reactivos.
43.2.2.1 Medio de mantenimiento de la cepa.
Peptona de carne: 6,0 g.
Triptona: 4,0 g.
Extracto de levadura: 3,0 g.
Extracto de carne: 1,5 g.
Glucosa: 1,0 g.
Agar: 10,0 a 20,0 g.
Agua: 1.000 ml.
pH: 6,5 a 6,6 (tras esterilización).
Puede utilizarse cualquier medio de cultivo comercial de composición análoga, que dé los mismos resultados.
43.2.2.2 Medio de base de la determinación.
Triptona: 10,0 g.
Extracto de levadura: 3,0 g.
Extracto de carne: 1,5 g.
Glucosa: 1,0 g.
Agar: 10,0 a 20,0 g.
Tween 80: 1 ml.
Agua: 1.000 ml.
pH: 6,5 (tras esterilización).
Puede utilizarse cualquier medio de cultivo comercial de composición análoga, que dé los mismos resultados.
43.2.2.3 Solución al 0,8 por 100 p/v de cloruro de sodio: disolver 8 g de cloruro de sodio en agua, diluir a 1.000 ml y esterilizar.
43.2.2.4 Mezcla de metanol/agua/ácido clorhídrico (43.2.2.6): 80/17,5/2,5 (v/v/v).
43.2.2.5 Tampón fosfato pH 6,5.
Hidrógeno fosfato de potasio KHPO: 22,15 g.
Kihidrógeno fosfato de potasio KHPO: 27,85 g.
Agua hasta 1.000 ml.
43.2.2.6 Acido clorhídrico, d= 1,18 - 1,19.
43.2.2.7 Acido clorhídrico, 0,1M.
43.2.2.8 Solución de hidróxido de sodio 1 M.
43.2.2.9 Solución de sulfuro de sodio 0,5 M aproximadamente.
43.2.2.10 Solución de púrpura de bromocresol al 0,04 por 100 (p/v)
Disolver 0,1 g de púrpura de bromocresol en 18,5 ml de solución 0,01 M de hidróxido de sodio. Completar hasta 250 ml con agua y homogeneizar.
43.2.2.11 Sustancia de referencia: bacitracina-cinc de actividad conocida (en UI).
43.3 Procedimiento.
43.3.1 Soluciones de referencia. Pesar una cantidad de sustancia de referencia (43.2.2.11) correspondiente a 1050 UI (según la actividad indicada). Añadir 5 ml de ácido clorhídrico 0,1 M (43.2.2.7) y dejar reposar quince minutos. Añadir 30 ml de agua, ajustar el pH a 4,5 con tampón fosfato (43.2.2.5) (unos 4 ml), completar hasta 50 ml con agua y homogeneizar (1 ml = 21 UI).
Preparar a partir de esta solución y mediante diluciones sucesivas con ayuda de tampón fosfato pH 6,5 (43.2.2.5), las soluciones siguientes:
S: 0,42 UI/ml.
S: 0,21 UI/ml.
S: 0,105 UI/ml.
S: 0,0525 UI/ml.
43.3.2 Preparación del extracto.
43.3.2.1 Extracción.
43.3.2.1.1 Premezclas y correctores minerales. Pesar una cantidad de muestra de 2,0 a 5,0 g, añadir 29,0 ml de la mezcla (43.2.2.4) y 0,1 ml de la solución de sulfuro de sodio (43.2.2.9); agitar brevemente. Comprobar que el pH es aproximadamente 2. Agitar durante diez minutos, añadir 30 ml de tampón fosfato (43.2.2.5), agitar durante quince minutos y centrifugar. Tomar una parte alícuota de la solución sobrenadante y ajustar el pH a 6,5 con solución de hidróxido de sodio 1 M (43.2.2.8) utilizando un pH-metro o la solución de púrpura de bromocresol como indicador (43.2.2.10).
Diluir con tampón fosfato (43.2.2.5) para obtener con tampón fosfato (42.2.2.5) para obtener una concentración supuesta en bacitracina-cinc de 0,42 UI/ml (= U).
43.3.2.1.2 Concentrados proteicos. Pesar una cantidad de muestra de 10,0 g, añadir 49,0 ml de mezcla (43.2.2.4) y 1,0 ml de la solución de sulfuro de sodio (43.2.2.9); agitar brevemente. Comprobar que el pH es aproximadamente 2. Agitar durante diez minutos, añadir 50 ml de tampón fosfato (43.2.2.5), agitar durante quince minutos y centrifugar. Tomar una parte alícuota de la solución sobrenadante y ajustar el pH a 6,5 con la solución de hidróxido de bromocresol como indicador (43.2.2.10).
Evaporar aproximadamente la mitad del volumen en un evaporador rotativo a una temperatura que no exceda de 35 ºC. Diluir con tampón fosfato (43.2.2.5) para obtener una concentración supuesta de bacitracina de cinc de 0,42 UI/ml (= U).
43.3.2.1.3 Otros piensos. Pesar una cantidad de muestra de 10 g (20,0 o para una concentración supuesta de bacitracina-cinc de 5 mg/kg). Añadir 24,0 ml de mezcla (43.2.2.4) y 1,0 ml de la solución sulfuro de sodio (43.2.2.9); homogeneizar durante diez minutos. Añadir 25 ml de tampón fosfato (43.2.2.5), agitar durante quince minutos, y centrifugar. Tomar 20 ml de la solución sobrenadante y ajustar el pH a 6,5 con solución de hidróxido de sodio (43.2.2.8), utilizando un pH neutro o la solución de púrpura de bromocresol (43.2.2.10) como indicador. Evaporar hasta 4 ml aproximadamente en un evaporador rotativo a una temperatura que no exceda de 35 ºC. Diluir el residuo con tampón fosfato (43.2.2.5) para obtener una concentración supuesta de bacitracina-cinc de 0,42 UI/ml (= U).
43.3.2.2 Soluciones del extracto. Preparar, a partir de la solución U y por diluciones sucesivas (1 + 1) con tampón fosfato (43.2.2.5) las soluciones U (concentración supuesta = 0,21 UI/ml), U (concentración supuesta = 0,105 UI/ml) y U (concentración supuesta = 0,0525 UI/ml).
43.3.3 Modalidades de determinación.
43.3.3.1 Inoculación del medio de cultivo. Sembrar a unos 50 ºC el medio de base de la determinación (43.2.2.2) con la suspensión bacteriana (43.2.1.2). Mediante ensayos preliminares en placas con el medio (43.2.2.2), determinar la cantidad de suspensión bacteriana que permite obtener para las diferentes concentraciones de bacitracina-cinc zonas de inhibición lo más amplias posibles sin dejar de ser nítidas.
43.3.3.2 Preparación de las cajas. La difusión en agar se efectúa en cajas con las cuatro concentraciones de la solución de referencia (S, S, S y S) y las cuatro concentraciones del extracto (U, U, U y U). Cada caja debe recibir necesariamente las cuatro concentraciones de referencia y del extracto. A tal fin hay que elegir la dimensión de las cajas de tal forma que se puedan excavar en el medio de agar por lo menos 8 cavidades de 10 a 13 mm de diámetro, cuyos centros no disten menos de 30 mm. Pueden emplearse como cajas, placas de vidrio planas, coronadas por un anillo de aluminio o de materia plástica de 200 mm de diámetro y 20 mm de altura.
Introducir en las cajas una cantidad el medio (43.2.2.2), sembrado tal como se indica en 43.3.3.1, que permita obtener una capa de unos 2 mm de grosor (60 ml para una caja de 200 mm de diámetro). Dejar solidificar, excavar las cavidades, y depositar en ellas volúmenes exactamente medidos de las soluciones de referencia y del extracto (0,10 a 0,15 ml por cavidad, según el diámetro). Repetir por lo menos cuatro veces cada concentración, de forma que cada determinación sea la evaluación de 32 zonas de inhibición.
43.3.3.3 Incubación. Incubar las cajas durante dieciséis a dieciocho horas a 30 ºC ± 2 ºC.
43.4 Cálculos.
Medir el diámetro de las zonas de inhibición con un error no superior a 0,1 mm. Para cada concentración, registrar las medidas medias en papel semilogarítmico, trasladando el logaritmo de las concentraciones en relación con los diámetros de las zonas de inhibición. Trazar las rectas más ajustadas para la solución de referencia y para el extracto, por ejemplo, mediante el procedimiento siguiente:
Determinar el punto más apropiado del nivel más bajo de la solución de referencia (SL) con ayuda de la fórmula:
(a) SL = 7S + 4S + S - 2S
10
Determinar el punto más apropiado del nivel más alto de la solución de referencia (SH) con ayuda de la fórmula:
(b) SH = 7S + 4S + S - 2S
10
Determinar del mismo modo los puntos más apropiados del extracto para el nivel más bajo (UL) y el nivel más alto (UH) sustituyendo S, S, S y S en las fórmulas anteriores por U, U, U y U.
Consignar los valores SL y SH en la misma gráfica. Al unir los dos puntos, se obtiene la recta más ajustada para la solución de referencia. Si se sigue el mismo método para UL y UH se obtiene la recta más ajustada para el extracto.
Si no hubiere ninguna interferencia, las rectas serían paralelas. En la práctica se consideran paralelas cuando (SH-SL) y (UH-SL) no difieren más de un 10 por 100 de su media.
Si las rectas no son paralelas, pueden eliminarse U y S o U y S. Los valores SL, SH, UL y UH que permiten obtener rectas más ajustadas, se calculan entonces con ayuda de las fórmulas siguientes:
5S + 2S - S 5S + 2S - S
(a) SL = ----------- o -----------
6 6
5S + 2S - S 5S + 2S - S
(b) SH = ----------- o -----------
6 6
y de fórmulas análogas para UL y UH. La utilización de esta alternativa obliga a respetar los mismos criterios de paralelismo. En el boletín analítico debe mencionarse la obtención de un resultado procedente de tres niveles.
Cuando las rectas se consideren paralelas, hay que calcular el logaritmo de la actividad relativa (log A) mediante una de las fórmulas siguientes, según el número de niveles (4 ó 3) utilizados para la valoración del paralelismo.
Para 4 niveles:
(c) log A = (U + U + U + U - S - S - S - S) x 0,602
U + U + S + S - U - U - S - S
Para 3 niveles:
(d) log A = (U + U + U - S - S - S) x 0,401
U + S - U - S
(d) log A = (U + U + U - S - S - S) x 0,401
U + S - U - S
Actividad del extracto de la muestra = actividad de la referencia correspondiente x A, es decir U = S x A.
Si la actividad relativa no se encuentra en la gama de valores comprendidos entre 0,5 y 2,0, ha de repetirse la determinación procediendo a los ajustes apropiados de las concentraciones del extracto o, en su caso, de las soluciones de referencia. Cuando esta actividad no pueda encuadrarse en la gama de los valores exigidos, el resultado se considerará aproximado y así se hará constar en el boletín de análisis.
Cuando las rectas no se consideren paralelas, se repetirá la determinación. Si tampoco ahora se lograse el paralelismo, la determinación se considerará insatisfactoria.
Expresar el resultado en miligramos de bacitracina-cinc por kilogramo de pienso.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas con la misma muestra por el mismo analista no deben exceder de:
2 mg/kg, en valor absoluto, para los contenidos de bacitracina-cinc inferiores a 10 mg/kg.
20 por 100 del resultado más alto, para los contenidos de 10 a 25 mg/kg.
5 mg/kg, en valor absoluto, para los contenidos de 25 a 50 mg/kg.
10 por 100 del resultado más alto, para los contenidos superiores a 50 mg/kg.
43.5 Referencias. Directiva de la Comisión de 20 de diciembre de 1983, modificando las Directivas 71/393, 72/199 y 78/633 (Directiva 84/4/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» de 18 de enero de 1984, número L 15/28, anexo III.
44. Flavofosfolipol
(Por difusión en agar)
44.1 Principio. El método permite dosificar el flavofosfolipol en los piensos, los concentrados y las premezclas. El límite inferior de dosificación es de 1 mg/kg.
Se somete la muestra a extracción por metanol diluido, mediante calentamiento a reflujo. El extracto se centrifuga, se purifica, si es necesario, en resinas intercambiadoras de iones, y se diluye. Se determina la actividad antibiótica por medida de la difusión del flavofosfolipol en un medio de agar, sembrado con Staphylococcus aureus. La difusión se pone de manifiesto por la formación de zonas de inhibición de microorganismo. El diámetro de dichas zonas se considera directamente proporcional al logaritmo de las concentraciones utilizadas.
44.2 Reactivos.
44.2.1 Microorganismo: Staphylococcus aureus ATCC 6538 P.
44.2.1.1 Mantenimiento de la cepa. Sembrar el medio de cultivo (44.2.2.1) en tubos inclinados, con Staphylococcus aureus. Incubar durante veinticuatro horas a 37 ºC, conservar en refrigerador a 4º C aproximadamente y renovar la siembra cada mes.
44.2.1.2 Preparación de la suspensión bacteriana. Tomar dos tubos que contengan el cultivo madre (4.2.2.1) y renovar la siembra cada semana. Incubar veinticuatro horas a 37 ºC y conservar en refrigerador a 4 ºC aproximadamente.
Veinticuatro horas antes de la dosificación, sembrar mediante dichos cultivos, de dos a cuatro tubos inclinados que contengan medio de cultivo (44.2.2.1).
Incubar de dieciséis a dieciocho horas a 37 ºC. Poner luego los gérmenes en suspensión en la solución de cloruro de sodio (44.2.2.3). La transmisión luminosa de la suspensión, medida a 578 nm bajo un espesor de 1 cm, por comparación con la solución de cloruro de sodio, deberá ser de 40 por 100 aproximadamente. Se podrán utilizar otros métodos si demuestran que producen una suspensión bacteriana análoga.
44.2.2 Medios de cultivo y reactivos.
44.2.2.1 Medio de mantenimiento de la cepa.
Peptona de carne: 6,0 g.
Triptona: 4,0 g.
Extracto de levadura: 3,0 g.
Extracto de carne: 1,5 g.
Glucosa: 1,0 g.
Agar: 15,0 g.
Agua: 1.000 ml.
pH = 6,5 después de la esterilización.
Se podrá utilizar cualquier medio de cultivo comercial de composición análoga y que dé los mismos resultados, por ejemplo Oxoid Antibiotic Medium (CM 327) agregado a agar Oxoid número 3 (L 13).
44.2.2.2 Medio de base de la dosificación.
44.2.2.2.1 Capa inferior.
Peptona de carne: 6,0 g.
Extracto de levadura: 3,0 g.
Extracto de carne: 1,5 g.
Agar: 10,0 g.
Agua: 1.000 ml.
pH = 6,5 después de la esterilización.
Se podrá utilizar cualquier medio de cultivo comercial de composición análoga y que dé los mismos resultados, por ejemplo Oxoid Antibiotic Medium 2 (CM 335) agregado a agar Oxoid número 3 (L 13).
44.2.2.2.2 Capa a sembrar. Medir (4.2.2.1) con 2 g de emulsión antiespumante de silicona. Por ejemplo SE 2 de Wacker Chemie Gmon, Munich.
44.2.2.3 Solución al 0,4 por 100 (p/v) de cloruro de sodio:
Disolver en agua 4 g de cloruro de sodio p.a., diluir hasta 1.000 ml y esterilizar.
44.2.2.4 Metanol puro.
44.2.2.5 Metanol al 50 por 100 (v/v). Diluir 500 ml de metanol con 500 ml de agua.
44.2.2.6 Metanol al 80 por 100 (v/v). Diluir 800 ml de metanol 44.2.2.4 con 200 ml de agua.
44.2.2.7 Tris (hidroximetil) aminometano p.a.
44.2.2.8 Solución metanólica al 1,5 por 100 (p/v) de cloruro de potasio. Disolver 1,5 g de cloruro de potasio p.a. en 20 ml de agua, completar hasta 100 ml con metanol (44.2.2.4).
44.2.2.9 Intercambiador de cationes: Dowex 50 WX8, 20-25 mesh, forma Na (cat, Serva número 41600) o equivalente.
44.2.2.10 Intercambiador de aniones: Dowex 1X2, 50 100 mesh, forma Cl/cat. Serva número 41010) o equivalente. Antes de utilizarlo, mantener el producto durante doce a catorce horas en metanol al 80 por 100 (44.2.2.6).
44.2.2.11 Lana de vidrio.
44.2.2.12 Papel indicador de pH (pH 6,6-8,1).
44.2.2.13 Acido ascórbico.
44.2.2.14 Sustancia patrón. Flavofosfolipol de actividad conocida.
44.3 Material y aparatos.
44.3.1 Tubo para cromatografía, de vidrio, diámetro interior: 9 mm, longitud 150 a 200 mm, provisto de llave en el estrechamiento inferior y de esmerilado normalizado (para empalme del embudo) en la parte superior.
44.3.2 Embudo con depósito de 250 ml, con llave esmerilada, normalizado.
44.3.3 Erlenmeyer de 250 ml, de esmerilado normalizado.
44.3.4 Refrigerante de reflujo, de esmerilado normalizado.
44.4 Procedimiento.
44.4.1 Soluciones patrón. Disolver una cantidad exactamente pesada de sustancia patrón (44.2.2.14) en metanol al 50 por 100 (44.2.2.5) y diluir para obtener una solución madre de flavofosfolipol de 100 microgramos/ml. Conservada en frasco tapado, a 4 ºC, dicha solución es estable durante dos meses.
Preparar a partir de dicha solución, y por diluciones sucesivas, mediante metanol al 50 por 100 (44.2.2.5) las soluciones siguientes:
S: 0,2 microgramo/ml.
S: 0,1 microgramo/ml.
S: 0,05 microgramo/ml.
S: 0,025 microgramo/ml.
44.4.2 Preparación del extracto.
44.4.2.1 Extracción.
44.4.2.1.1 Concentrados, premezclas y correctores minerales. Pesar una cantidad de muestra de 2 a 5 g y añadir unos 150 mg de ácido ascórbico (44.2.2.13). Mezclar con 150 ml de metanol al 50 por 100 (44.2.2.5) en un erlenmeyer (44.2.3.3) y ajustar el pH a 8,1-8,2 mediante unos 400 mg de tris (hidroximetil) aminometano (44.2.2.7). Controlar el pH mediante papel indicador (44.2.2.12). Dejar macerar quince minutos, ajustar de nuevo el pH a 8,1-8,2, mediante tris (hidroximetil) aminometano (44.2.2.7), y luego hervir durante diez minutos con refrigerante a reflujo (44.2.3.4), agitando constantemente. Dejar enfriar, centrifugar y decantar el extracto.
44.4.2.1.2 Otros piensos. Pesar una cantidad de muestra de 5 a 30 g que contenga al menos 30 microgramos de flavofosfolipol. Mezclar a 150 ml de metanol al 50 por 100 (44.2.2.5) en un erlenmeyer (44.2.3.3) y ajustar el pH a 8,1-8,2 con 400 mg aproximadamente de tris (hidroximetil) aminometano (4.2.2.7). Controlar el pH mediante papel indicador. Dejar macerar quince minutos, ajustar de nuevo el pH a 8,1-8,2 con tris (hidroximetil) aminometano y luego hervir durante diez minutos con refrigerante de reflujo (44.2.3.4) agitando constantemente. Dejar enfriar, centrifugar y decantar el extracto.
44.4.2.2 Purificación (se podrá omitir dicha modalidad para los concentrados, las premezclas y los correctores minerales).
Mezclar 110 ml del extracto con 11 g de intercambiador de cationes (44.2.2.9), hervir durante un minuto con refrigerante a reflujo (44.2.3.4) agitando constantemente. Separar el intercambiador de cationes por centrifugación o filtración. Mezclar 100 ml del extracto con 150 ml de metanol (44.2.2.4) y dejar reposar la solución de doce a quince horas a 4 ºC. Eliminar la materia floculada por filtración en frío.
Poner en el extremo inferior de un tubo (44.2.3.1) un tapón de lana de vidrio (44.2.2.11), verter en el tubo 5 ml de intercambiador de aniones (44.2.2.10) y lavar la columna con 100 ml de metanol al 80 por 100 (44.2.2.6). Luego trasvasar a la columna a través del embudo (44.2.3.2) un volumen de filtrado de 100 ml que se supone contiene por lo menos 16 microgramos de flavofosfolipol (200 ml para una muestra de 30 g de pienso a 1 ppm). Si fuere necesario, diluir el filtrado antes de trasvasarlo a la columna con metanol al 80 por 100 (44.2.2.6) para obtener una presunta concentración en flavofosfolipol de 16 microgramos en 100 ml. Regular el caudal de salida del líquido a 2 ml aproximadamente por minuto. Eliminar la totalidad del filtrado. Lavar luego la columna con 50 ml de metanol al 80 por 100 (44.2.2.6) y eliminar el filtrado.
Eluir el flavofosfolipol mediante la solución metanólica de cloruro de potasio (44.2.2.8) manteniendo el caudal de goteo aproximadamente de 2 ml por minuto. Recoger 50 ml de la elución en un matraz aforado, añadir 30 ml de agua y homogeneizar. Esta disolución debe tener un contenido en flavofosfolipol de 0,2 microgramos/ml (= U).
44.4.2.3 Soluciones del extracto. Si fuera necesario, (en particular en los casos en que se hubiera omitido la purificación) diluir el extracto obtenido en 44.4.2.1.1 con metanol al 50 por 100 (44.2.2.5) para obtener una supuesta concentración en flavofosfolipol de 0,2 microgramo/ml (= U).
Preparar a partir de la solución U por diluciones sucesivas (1 + 1) mediante metanol al 50 por 100 (44.2.2.5) las soluciones U (concentración supuesta = 0,1 microgramo/ml), U (concentración supuesta = 0,05 microgramo/ml) y U (concentración supuesta = 0,025 microgramo/ml).
44.4.3 Modalidades de la dosificación.
44.4.3.1 Inoculación del medio de cultivo. Sembrar a 50 ºC aproximadamente el medio de base de la dosificación (44.2.2.2.2) con la suspensión bacteriana (44.2.1.2). Mediante ensayos preliminares en capas con el medio (44.2.2.2.2) determinar la cantidad de suspensión bacteriana que permita obtener para las distintas concentraciones en flavofosfolipol, zonas de inhibición tan extensas como sea posible y que permanezcan aún nítidas (unos 30 ml por litro).
44.4.3.2 Preparación de las cajas. La difusión en agar se realiza en cajas con las cuatro concentraciones de la solución patrón (S, S, S y S) y las cuatro concentraciones del extracto (U, U, U y U). Cada caja deberá recibir necesariamente las cuatro concentraciones del patrón y del extracto. A tal fin, escoger la dimensión de las cajas de forma tal que se puedan ahuecar en el medio de agar al menos 8 cavidades de 10 a 13 mm de diámetro, cuyos centros no estén separados por menos de 30 mm. Se podrá utilizar como cajas, placas de vidrio planas, coronadas por un anillo de aluminio o de materia plástica de 200 mm de diámetro y 20 mm de altura.
Introducir en las cajas una cantidad del medio (44.2.2.2.1) que permita obtener una capa de 1,5 mm aproximadamente de espesor (45 ml para una caja de 200 mm de diámetro). Dejar solidificar y añadir una cantidad del medio (44.2.2.2.2), sembrado como se indica en el punto 44.3.3.1, que permita obtener una capa de 1 mm de espesor (30 ml para una caja de 200 mm de diámetro). Dejar solidificar, ahuecar las cavidades y depositar en las mismas los volúmenes exactamente medidos de las soluciones patrón y del extracto (0,10 a 0,15 ml por cavidad, según diámetro).
Hacer al menos cuatro repeticiones de cada concentración, de modo que cada determinación sea objeto de una evaluación de 32 zonas de inhibición.
43.4.3.3 Incubación. Incubar las cajas de dieciséis a dieciocho horas a 29-30 ºC.
44.5 Cálculos. Medir el diámetro de las zonas de inhibición con una aproximación de 0,1 mm. Para cada concentración, registrar las medidas en papel semilogarítmico anotando el logaritmo de las concentraciones frente a los diámetros de las zonas de inhibición. Trazar las rectas mejor ajustadas para la solución patrón y para el extracto procediendo, por ejemplo, de la siguiente manera:
Determinar el punto más apropiado del nivel más bajo de la solución patrón (SL) mediante la fórmula:
(a) SL = 7S + 4S + S - 2S
10
Determinar el punto más apropiado del nivel más elevado de la solución patrón (SH) mediante la fórmula:
(b) SH = 7S + 4S + S - 2S
10
Determinar del mismo modo los puntos más apropiados del extracto para el nivel más bajo (UL) y el nivel más elevado (UH) sustituyendo S, S, S y S en las fórmulas arriba mencionadas por U, U U y U.
Representar los valores SL y SH en el mismo gráfico. Uniendo los dos puntos, se obtendrá la recta más ajustada para la solución patrón. Procediendo del mismo modo para UL y UH, se conseguirá la recta más ajustada para el extracto.
En ausencia de cualquier interferencia, las rectas deberían ser paralelas. En la práctica, se las considerará como si fueran paralelas cuando (SH-SL) y (UH-UL) no difieran en más del 10 por 100 de su media.
Si las rectas no fueran paralelas, se podrán eliminar o bien U y S o U y S. Los valores SL, SH, UL y UH que permitan obtener las rectas más ajustadas se calcularán entonces mediante las fórmulas siguientes:
5S + 2S - S 5S + 2S - S
(a') SL = ----------- o -----------
6 6
5S + 2S - S 5S + 2S - S
(b) SH = ----------- o -----------
6 6
y fórmulas análogas para UL y UH. La utilización de dicha alternativa deberá igualmente ser objeto de una verificación en cuanto al paralelismo de las rectas indicado más arriba. Se deberá mencionar en el boletín de análisis la obtención de un resultado procedente de tres niveles.
Cuando se consideren las rectas como paralelas, se calculará el logaritmo de la actividad relativa (log A), mediante alguna de las fórmulas siguientes:
(c) log A = (U + U + U + U - S - S - S - S) x 0,602
U + U + S + S - U - U - S - S
Para 3 niveles:
(d) log A = (U + U + U - S - S - S) x 0,401
U + S - U - S
(d') log A = (U + U + U - S - S - S) x 0,401
U + S - U - S
Actividad real = actividad supuesta x actividad relativa.
Cuando las rectas no se consideren como no paralelas, repetir la determinación. Si la misma continuara sin permitir alcanzar el paralelismo, calcular el logaritmo de la actividad relativo (log. A) mediante la fórmula (c). Sin embargo se deberá considerar el resultado obtenido como aproximado y será procedente mencionarlo en el boletín de análisis.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones realizadas en la misma muestra por el mismo analista no deberá sobrepasar:
- 0,5 mg/kg, en valor absoluto, para los contenidos en flavofosfolipol de 1 a 2 mg/kg.
- 25 por 100 del resultado más elevado para los contenidos superiores a 2 mg/kg y hasta 10 mg/kg.
- 20 por 100 del resultado más elevado, para los contenidos superiores a 10 mg/kg y hasta 25 mg/kg.
- 5 mg/kg, en valor absoluto, para los contenidos superiores a 25 mg/kg y hasta 50 mg/kg.
- 10 por 100 del resultado más elevado, para los contenidos superiores a 50 mg/kg.
44.6 Referencias. Octava Directiva de la Comisión, de 15 de junio de 1978 (78/633/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 206, de 29 de julio de 1978, página 43, páginas 5 a 9 del anexo.
45. Tilosina
(Por difusión en agar)
45.1 Principio. El método permite determinar la tilosina en los piensos, los concentrados y en las premezclas. El límite inferior de la determinación es de 2 mg/kg.
La muestra se trata mediante solución tampón fosfato de pH 8, previamente llevada a 80 ºC, y se somete a continuación a extracción por metanol. Previa centrifugación, el extracto se diluye y su actividad antibiótica se determina por la medida de la difusión de la tilosina en medio de agar sembrado con Sarcina lutea. La difusión queda indicada por la formación de zonas de inhibición en presencia del microorganismo. El diámetro de dichas zonas es directamente proporcional al logaritmo de la concentración del antibiótico.
45.2 Reactivos.
45.2.1 Microorganismo: Sarcina lutea ATCC número 9341.
45.2.1.1 Mantenimiento de la cepa. Sembrar Sarcina lutea en tubo de agar inclinado con el medio de cultivo (45.2.2.1) ajustado a pH 7,0. Incubar durante una noche a 35 ºC aproximadamente. Conservar el cultivo en refrigerador y resembrar todos los meses sobre agar inclinado.
45.2.1.2 Preparación de la suspensión de gérmenes. Recoger los gérmenes de un tubo de agar inclinado (45.2.1.1) de reciente preparación, con 2 a 3 ml de suero fisiológico (45.2.2.4). Sembrar con dicha suspensión un frasco de Roux que contenga 250 ml del medio de cultivo (45.2.2.1), ajustado a pH 7,0. Incubar durante veinticuatro horas a 35 ºC, recoger los gérmenes con 25 ml de suero fisiológico (45.2.2.4). Homogeneizar y diluir dicha suspensión para obtener una transmisión luminosa del 75 por 100 aproximadamente a 650 nm.
Conservada en refrigerador, dicha suspensión es utilizable durante una semana.
Mediante unos ensayos preliminares sobre placas con el medio de base de la determinación (45.2.2.1), determinar la cantidad de inóculo que permita obtener, para las diferentes concentraciones de tilosina empleadas, zonas de inhibición tan extensas como sea posible que además estén nítidas. La inoculación del medio de cultivo se hace a 48-50 ºC.
45.2.2 Medios de cultivo y reactivos.
45.2.2.1 Medio de base para la determinación.
Glucosa: 1,0 g.
Peptona trípsica: 10,0 g.
Extracto de carne: 1,5 g.
Extracto de levadura: 3,0 g.
Agar según calidad: 10,0 a 20,0 g.
Agua destilada hasta 1.000 ml.
Ajustar en el momento de empleo a pH 7,0 para el mantenimiento de la cepa y la preparación de la suspensión de gérmenes y a pH 2,0 para la determinación.
Cualquier medio de cultivo comercial de composición análoga y que dé los mismos resultados, puede ser empleado.
45.2.2.2 Tampón fosfato pH 8.
Dihidrógeno fosfato de potasio KHPO p.a.: 0,523 g.
Hidrógeno fosfato de potasio KHPO p.a.: 16,730 g.
Agua destilada hasta 1.000 ml.
45.2.2.3 Tampón fosfato pH 7.
Dihidrógeno fosfato de potasio KHPO p.a.: 5,5 g.
Hidrógeno fosfato de potasio KHPO p.a.: 13,6 g.
Agua destilada hasta 1.000 ml.
45.2.2.4 Suero fisiológico estéril.
45.2.2.5 Metanol puro.
45.2.2.6 Metanol al 10 por 100 (v/v).
45.2.2.7 Mezcla de tampón fosfato (45.2.2.2)/metanol puro (60/40 v/v).
45.2.2.8 Sustancia de referencia: tilosina conocida.
45.3 Procedimiento.
45.3.1 Soluciones de referencia. Secar la solución de referencia (45.2.2.8) durante tres horas a 60 ºC en una estufa de vacío (5 mm de mercurio). Pesar 10 a 50 mg a un matraz aforado, disolverlos en 5 ml de metanol (45.2.2.5) y diluir la solución mediante el tampón fosfato pH 7 (45.2.2.3) para obtener una concentración en tilosina base de 1.000 microgramos/ml. A partir de dicha solución-madre, preparar diluyendo mediante la mezcla (45.2.2.7) una solución de trabajo de referencia que contenga 2 microgramos de tilosina base por ml.
Preparar a continuación por diluciones sucesivas (1 + 1) con ayuda de la mezcla (45.2.2.7), las concentraciones siguientes:
S: 1 microgramos/ml.
S: 0,5 microgramos/ml.
S: 0,25 microgramos/ml.
45.3.2 Extracción. Tomar para los productos muy concentrados en tilosina una porción de muestra de 10 g; para las premezclas y piensos una porción de muestra de 20 g. Añadir 60 ml de tampón fostato pH 8 (45.2.2.2), previamente calentado a 80 ºC, y homogeneizar durante dos minutos (electrodomésticos Ultra-turrax etc.)
Dejar reposar durante diez minutos, añadir 40 ml de metanol (45.2.2.5) y homogeneizar durante cinco minutos. Centrifugar, tomar una parte alícuota de extracto y diluir mediante la solución (45.2.2.7) para obtener una concentración supuesta en tilosina de 2 microgramos/ml (= U). Preparar a continuación las concentraciones U, U y U por diluciones sucesivas (1 + 1) con ayuda de la solución (45.2.2.7).
Para los contenidos inferiores a 10 mg/kg evaporar el extracto en seco en un evaporador rotativo a 35 ºC y recoger el residuo mediante metanol al 40 por 100 (45.2.2.6).
45.3.3 Modalidades de la determinación.
45.3.3.1 Siembra del medio de cultivo. Sembrar a 48 - 50 ºC el medio de base de la determinación (45.2.2.1), ajustado a pH 8, con la suspensión de gérmenes (45.2.1.2).
45.3.3.2 Preparación de las cajas. La difusión sobre agar se efectúa en unas cajas con las cuatro concentraciones de la solución de referencia (S, S, S y S) y las 4 concentraciones del extracto (U, U, U y U). Cada caja deberá recibir necesariamente las cuatro concentraciones de referencia y del extracto.
A tal fin, escoger las dimensiones de las cajas de tal forma que se puedan practicar en el medio de agar al menos ocho cavidades de 10 a 13 mm de diámetro. Calcular la cantidad del medio de cultivo sembrado (45.3.3.1) que habrá de emplearse de modo que se pueda obtener un recubrimiento uniforme de 2 mm aproximadamente de espesor. Es preferible emplear como cajas, placas de vidrio planas, provistas de un anillo de aluminio o de material plástico perfectamente plano de 200 mm de diámetro y 20 mm de altura.
Introducir en las cavidades mediante pipeta cantidades exactamente medidas de solución de antibiótico comprendidas entre 0,10 y 0,15 ml, según diámetro.
Para cada muestra, hacer al menos cuatro repeticiones de difusión con cada concentración, de forma que cada determinación sea objeto de una evaluación de 32 zonas de inhibición.
45.3.3.3 Incubación. Incubar las cajas durante una noche a 35 ± 37 ºC.
45.4 Cálculos. Medir el diámetro de las zonas de inhibición, preferentemente por proyección. Representar las medidas sobre papel semilogarítmico, llevando el logaritmo de las concentraciones con relación a los diámetros de las zonas de inhibición. Trazar las rectas de solución de referencia y del extracto. En ausencia de interferencias, las dos rectas deberán ser paralelas.
El logaritmo de la actividad relativa está calculado por la siguiente fórmula:
(U + U + U + U - S - S - S - S) x 0,602
U + U + S + S - U - U 4 S - SActividad real = actividad supuesta x actividad relativa.
La diferencia ente los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe sobrepasar el 10 por 100, en valor relativo.
45.5 Referencias. Tercera Directiva de la Comisión de 27 de abril de 1972 (72/199/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 123/6, de 29 de mayo de 1972.
46. Espiramicina
(Método por difusión sobre agar)
46.1 Principio. El método permite determinar la espiramicina en piensos y premezclas. El límite inferior de detección es de 1 ppm (1 mg de espiramicina equivale a 3.200 unidades internacionales). La muestra se somete a extracción con una mezcla de metanol y de tampón fosfato-hidrogenocarbonato a pH 8. El extracto se decanta o centrifuga, y después se diluye. La actividad antibiótica del extracto se determina midiendo la difusión de la espiramicina en un medio de agar, sembrado con Micrococus luteus. La difusión se manifiesta por la formación de zonas de inhibición del microorganismo. El diámetro de dichas zonas se considera directamente proporcional al logaritmo de la concentración de antibiótico para la gama de concentraciones utilizadas.
46.2 Reactivos.
46.2.1 Microorganismo: Micrococus luteus ATCC 9341 (NCTC 8340, NCIB 8553).
46.2.2 Mantenimiento de la cepa. Sembrar el medio de cultivo (46.2.4) en tubos inclinados, con Micrococus luteus. Incubar durante veinticuatro horas a 30 ºC, conservar en refrigerador a 4 ºC aproximadamente y renovar la siembra cada quince días.
46.2.3 Preparación de la suspensión bacteriana (46.5.1). Recoger los gérmenes en un tubo de agar (46.2.2) de reciente preparación, con ayuda de 2 a 3 ml de solución de cloruro de sodio (46.2.6). Sembrar con esta suspensión 250 ml de medio de cultivo (46.2.4) en un matraz de Roux e incubar durante dieciocho a veinte horas a 30 ºC. Recoger los gérmenes en 25 ml de solución de cloruro de sodio (46.2.6) y homogeneizar. Diluir la suspensión hasta 1/10 con ayuda de la solución de cloruro de sodio (46.2.6). La transmisión luminosa de la suspensión, medida a 650 nm, bajo un espesor de 1 cm por comparación con la solución de cloruro de sodio (46.2.6), deberá ser de 75 por 100 aproximadamente. Esta suspensión puede conservarse una semana a 4 ºC aproximadamente.
46.2.4 Medios de cultivo de mantenimiento de la cepa (46.5.2).
Peptona de carne: 6,0 g.
Triptona: 4,0 g.
Extracto de levadura: 3,0 g.
Extracto de carne: 1,5 g.
Glucosa: 1,0 g.
Agar: 10,0 a 20,0 g.
Agua: 1.000 ml.
pH 6,5 - 6,6 (después de la esterilización).
46.2.5 Medio de cultivo de base de la determinación (46.5.2).
Triptona: 5,0 g.
Extracto de levadura: 4,0 g.
Extracto de carne: 3,0 g. Agar: 10,0 a 20,0 g.
Agua: 1.000 ml.
pH: 8,0 (después de la esterilización).
46.2.6 Solución al 0,8 por 100 (p/v) de cloruro de sodio. Disolver en agua 8 g de cloruro de sodio, diluir en 1.000 ml y esterilizar.
46.2.7 Tampón fosfato-hidrogenocarbonato, pH 8,0.
Hidrogenofosfato de potasio KHPO: 16,7 g.
Dihidrogenofosfato de potasio KHPO: 0,5 g.
Hidrógeno carbonato de sodio NaHCO: 20,0 g.
Agua hasta 1.000 ml.
46.2.8 Mezcla de metanol y de tampón fosfato-bicarbonato (46.2.7). 50/50 (v/v).
46.2.9 Sustancia patrón. Espiramicina de actividad conocida (UI).
46.2.10 Solución patrón. Disolver una cantidad exactamente pesada de la sustancia patrón (46.2.9) en la mezcla (46.2.8) y diluir con la misma mezcla para obtener una solución madre de 1000 UI de espiramicina/ml.
Conservada en frasco con tapón esmerilado a 4 ºC, esta solución es estable durante cinco días.
Preparar a partir de esta solución y por diluciones sucesivas con ayuda de la mezcla (46.2.8) las soluciones siguientes:
S: 1 UI/ml.
S: 0,5 UI/ml.
S: 0,25 UI/ml.
S: 0,125 UI/ml.
46.3 Procedimiento.
46.3.1 Extracción. Pesar una cantidad de muestra de 20,0 g para los piensos y de 1,0 a 20,0 g para las premezclas. Añadir 100 ml de mezcla (46.2.8) y agitar durante treinta minutos.
Centrifugar o decantar, diluir después la solución que flota en la superficie con ayuda de la mezcla (46.2.8) para obtener una concentración supuesta en espiramicina de 1 UI/ml (U).
Para los contenidos en espiramicina inferiores a 2,5 mg/kg de pienso, efectuar la extracción como sigue. Pesar una cantidad de muestra de 20,0 g. Añadir 100 ml de mezcla (46.2.8), agitar durante treinta minutos, centrifugar después durante unos minutos. Tomar 50 ml de la solución sobrenadante y evaporar hasta 4 ml aproximadamente bajo presión reducida en un rotavapor a una temperatura que no sobrepase los 40 ºC. Diluir el residuo con ayuda de la mezcla (46.2.8), para obtener una concentración supuesta en espiramicina 1 UI/ml (U).
Partiendo de la solución U, preparar por diluciones sucesivas (1 + 1), con ayuda de la mezcla (46.2.8), las soluciones cuyas concentraciones supuestas sean: U (0,5 UI/ml) U (0,25 UI/ml) y U (0,125 UI/ml).
46.3.2 Inoculación del medio de cultivo. Sembrar a unos 50 ºC aproximadamente el medio de base de la determinación (46.2.5) con la suspensión bacteriana (46.2.3). Mediante ensayos preliminares en placas con el medio (46.2.4), determinar la cantidad de suspensión bacteriana que permita obtener para las diferentes concentraciones de espiramicina, zonas de inhibición lo más extensas posibles y que estén todavía limpias.
46.3.3 Preparación de las placas. La difusión en agar se efectúa en unas placas con cuatro concentraciones de la solución patrón (S, S, S y S) y las cuatro concentraciones del extracto (U, U, U y U). Cada placa debe recibir necesariamente las cuatro concentraciones del patrón y del extracto. A tal efecto, hay que elegir las dimensiones de las placas de forma que se puedan efectuar en el agar por lo menos ocho cavidades de 10 a 13 mm de diámetro, cuyos centros se hallen a una distancia de, por lo menos, 30 mm. Como placas pueden utilizarse placas de vidrio planas, coronadas por un anillo de aluminio o de materia plástica de 200 mm de diámetro y 20 mm de altura.
Introducir en las placas una cantidad del medio (46.2.5), sembrado tal como se indica en (46.3.2), que permita obtener una capa de 2 mm de espesor (60 ml para una placa de 200 mm de diámetro). Dejar solidificar, efectuar las cavidades y depositar volúmenes exactamente medidos de soluciones del patrón y del extracto (0,10 a 0,15 ml por cavidad, según diámetro). Realizar por lo menos cuatro repeticiones de cada concentración, de modo que cada determinación sea objeto de una evaluación de 32 zonas de inhibición. Incubar las placas de dieciséis a dieciocho horas a 30 ºC ± 2 ºC.
46.4 Cálculos. Medir el diámetro de las zonas de inhibición con una precisión de 0,1 mm. Para cada concentración, registrar los valores medios en papel semilogarítmico, llevando los logaritmos de las concentraciones sobre los diámetros de las zonas de inhibición. Trazar las rectas más ajustadas para la solución patrón y para el extracto procediendo, por ejemplo, como sigue:
Determinar el punto más apropiado del nivel más bajo de la solución de patrón (SL) con ayuda de la fórmula:
(a) SL = 7s + 4s + s - 2s
10
Determinar el punto más apropiado del nivel más elevado de la solución patrón (SH) mediante la fórmula:
(b) SH = 7s + 4s + s - 2s
10
Determinar de la misma manera los puntos más apropiados del extracto para el nivel más bajo (UL) y el nivel más alto (UH) sustituyendo s, s, s y s en las fórmulas antes citadas por u, u, u y u. Siendo las letras minúsculas «s» y «u» los diámetros de las zonas de inhibición. Llevar los valores SL y SH a la misma gráfica. Uniendo los dos puntos se obtiene la recta más ajustada para la solución patrón. Procediendo del mismo modo para UL y UH se obtiene la recta más ajustada para el extracto.
Si no hay interferencia, las rectas serán paralelas. En la práctica, se las considera paralelas cuando SH-SL y UH-UL no difieren en más de un 10 por 100 de su medio.
Si las rectas no son paralelas, se pueden eliminar ya sea u y s o u y s. Los valores SL, SH, UL y UH que permiten obtener las rectas más ajustadas se calculan entonces con ayuda de las fórmulas siguientes:
5s + 2s - s 5s + 2s - s
(a') SL = ----------- o -----------
6 6
5s + 2s - s 5s + 2s - s
(b') SH = ----------- o -----------
6 6
y fórmulas análogas para UL y UH. La utilización de esta alternativa obliga a que sean respetados los mismos criterios de paralelismo. La obtención de un resultado procedente de tres niveles debe mencionarse en el boletín de análisis.
Cuando las rectas se consideran paralelas, calcular el logaritmo de la actividad relativa (log. A) mediante una de las fórmulas que siguen, según el número de niveles (cuatro o tres) utilizados para la evaluación del paralelismo.
Para cuatro niveles:
(c) log A = (u + u + u + u - s - s - s - s) x 0,602
u + u + s + s - u - u - s - s
Para 3 niveles:
(d) log A = (u + u + u - s - s - s) x 0,401
u + s - u - s
(d') log A = (u + u + u - s - s - s) x 0,401
u + s - u - s
Actividad del extracto de la muestra = Actividad del patrón correspondiente x A
(U - S x A)
Si la actividad relativa no se encuentra en la gama de valores comprendidos entre 0,5 y 2,0 repetir la determinación procediendo a los ajustes apropiados de las concentraciones del extracto o, eventualmente, de las soluciones patrón. Cuando esta actividad no pueda trasladarse a la gama de los valores requeridos, el resultado deberá considerarse aproximado y esta indicación habrá de anotarse en el boletín de análisis.
Cuando las rectas se consideren no paralelas, repetir la determinación. Si el paralelismo no se alcanza nunca, la determinación deberá considerarse insatisfactoria.
Expresar el resultado en mg de espiramicina base por kg de pienso.
Las diferencias de los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas con la misma muestra por la misma persona no debe superar:
- 2 mg/kg, en valor absoluto, para contenidos de espiramicina base inferiores a 10 mg/kg.
- El 20 por 100 del resultado más alto para contenidos de 10 a 25 mg/kg.
- 5 mg/kg, en valor absoluto, para los contenidos de 25 a 50 mg/kg.
- El 10 por 100 del resultado más alto para los contenidos superiores a 50 mg/kg.
46.5 Observaciones.
46.5.1 Pueden utilizarse otros métodos, siempre que esté demostrado que producen suspensiones bacterianas análogas.
46.5.2 Puede utilizarse cualquier medio de cultivo comercial de composición análoga que dé los mismos resultados.
46.6 Referencias. Décima Directiva Comunitaria, de 25 de julio de 1984, 84/425/CEE. «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 238/34, de 6 de septiembre de 1984.
47. Monensina sódica
(Método por difusión sobre agar)
47.1 Principio. El método permite determinar monensina sódica en piensos y premezclas. El límite inferior de detección es de 10 mg/kg (1 mg de monensina sódica equivale a 1000 U, «UK»).
La muestra se extrae con metanol al 90 por 100. Al extracto se le aplica los tratamientos apropiados según el contenido de monensina sódica de la muestra. Su actividad antibiótica se determina por medida de la difusión de monensina sódica en medio de agar sembrado con Bacillus subtilis. La difusión se manifiesta por la formación de zonas de inhibición de microorganismo. El diámetro de estas zonas se considera directamente proporcional al logaritmo de la concentración en antibiótico para la gama de concentraciones utilizadas. La sensibilidad de este método se reduce en presencia de iones sodio.
47.2 Material y aparatos.
47.2.1 Evaporador rotativo, con matraz de fondo redondo de 250 ml.
47.2.2 Columnas de vidrio para cromatografía, diámetro interior: 25 mm, longitud: 400 mm, con un diámetro de 2 mm en el extremo inferior.
47.2.3 Columna de vidrio para cromatografía, diámetro interior: 11 mm, longitud: 300 mm aproximadamente, con un diámetro de 2 mm en el extremo inferior.
47.3 Reactivos.
47.3.1 Microorganismo: Bacillus subtilis ATCC 6633 (NCIB 8054).
47.3.2 Conservación de la cepa.
Sembrar el medio de cultivo (47.3.4), en tubos inclinados y con Bacillus subtilis. Incubar durante una noche a 30 ºC, conservar en frigorífico a 4 ºC y renovar la siembra todos los meses.
47.3.3 Preparación de la suspensión de esporas (47.6.1). Recoger los gérmenes de un tubo de agar (47.3.2) de reciente preparación, con ayuda de 2 a 3 ml de agua estéril. Sembrar con esta suspensión 300 ml de medio de cultivo (47.3.4) en un frasco de Roux e incubar de tres a cinco días a 30 ºC. Después de controlar la esporulación al microscopio, recoger las esporas en 15 ml de etanol (47.3.6) y homogeneizar. Esta suspensión puede conservarse cinco meses a 4 ºC aproximadamente.
47.3.4 Medio de cultivo de mantenimiento de la cepa (47.6.2).
Triptona: 10,0 g.
Extracto de levadura: 3,0 g.
Extracto de carne: 1,5 g.
Glucosa: 1,0 g.
Agar (según calidad): 10,0 a 20,0 g.
Agua: 1.000 ml.
pH: 6,5 (después de la esterilización).
47.3.5 Medio de cultivo base para la determinación.
Glucosa: 10,0 g.
Extracto de levadura: 2,5 g.
Hidrogenofosfato de potasio (KHPO): 0,69 g.
Dihidrogenofosfato de potasio (KHPO): 0,45 g.
Agar (según calidad): 10,0 a 20,0 g.
Agua: 1.000 ml.
pH: 6,0 (después de la esterilización).
47.3.6 Etanol al 20 por 100 (v/v). Diluir 200 ml de etanol con 800 ml de agua.
47.3.7 Metanol anhidro.
47.3.8 Metanol al 90 por 100 (v/v). Diluir 900 ml de metanol (47.3.7) con 100 ml de agua.
47.3.9 Metanol al 50 por 100 (v/v). Diluir 500 ml de metanol (47.3.7) con 500 ml de agua.
47.3.10 Oxido de aluminio granulado (alcoa F,20 mesh: Activated Alumina UG: F. Lancester and Co., o equivalente).
47.3.11 Sustancia patrón: monensina sódica de actividad conocida (disponible en Internacional Laboratory for Biological Standards, Central Veterinary Laboratory, Weybridge, Surrey Kt15 3 NB, Gran Bretaña).
47.3.12 Soluciones de patrón. Disolver una cantidad exactamente pesada de la sustancia patrón (47.3.11) en metanol (47.3.7), diluir para obtener una solución madre de monensina sódica de 800 microgramos/ml. Conservar en frasco tapado a 4 ºC, esta solución es estable durante dos semanas.
Preparar a partir de esta solución y por diluciones sucesivas con metanol al 50 por 100 (47.3.9), las siguientes soluciones:
S: 8 microgramos/ml.
S: 4 microgramos/ml.
S: 2 microgramos/ml.
S: 1 microgramos/ml.
47.4 Procedimiento.
47.4.1 Extracción. Premezclas. Pesar 2,0 g de muestra, añadir 100 ml de metanol al 90 por 100 (47.3.8), homogeneizar y centrifugar a continuación durante algunos minutos. Diluir la solución sobrenadante con metanol al 50 por 100 (47.3.9) para obtener una concentración aproximada en monensina sódica de 8 microgramos/ml (U).
47.4.2 Extracción. Piensos en los que el contenido en monensina sódica no sea inferior a 50 mg/kg.
Pesar de 10,0 a 20,0 g de muestra, añadir 100 ml de metanol al 90 por 100 (47.3.8), homogeneizar durante quince minutos y dejar reposar.
Introducir un tapón de algodón en el extremo inferior de la columna de vidrio (47.2.2), añadir el óxido de aluminio (47.3.10), dando ligeras sacudidas a la columna, hasta que el relleno tenga de 75 a 80 mm de altura.
Decantar el extracto en la columna de óxido de aluminio y recoger el filtrado. Diluir 30 ml del filtrado a 50 ml con agua.
Diluir enseguida con metanol al 50 por 100 (47.3.9) para obtener una concentración aproximada en monensina sódica
de 8 microgramos/ml (U).
47.4.3 Extracción. Piensos en los que el contenido en monensina sódica es inferior a 50 mg/kg (hasta el límite de 10 mg/kg).
Pesar de 10,0 a 20,0 g de muestra, añadir 100 ml de metanol al 90 por 100 (47.3.8), homogeneizar durante quince minutos. Centrifugar para obtener un extracto limpio.
Tomar 40 ml de líquido sobrenadante para una muestra cuyo contenido en monensina sódica sea de 20 mg/kg; 80 ml para una muestra cuyo contenido sea de 10 mg/kg. Evaporar al vacío con rotavapor hasta sequedad (47.2.1) a una temperatura no superior a 40 ºC. Disolver el residuo con 10 ml de metanol al 90 por 100 (47.3.8).
Introducir un tapón de algodón en el extremo inferior de la columna de vidrio (47.2.3), añadir el óxido de aluminio (47.3.10), dando ligeras sacudidas a la columna, hasta que el relleno tenga de 75 a 80 mm de altura.
Decantar la solución metanólica del residuo sobre la columna de óxido de aluminio y recoger el filtrado. Lavar la columna con 10 ml de metanol al 90 por 100 (47.3.8) y unir al filtrado anterior.
Evaporar la solución al vacío en rotavapor a sequedad (47.2.1) una temperatura inferior a 40 ºC. Disolver el resíduo con 10 ml de metanol anhidro (47.3.7) y completar a 20 ml con agua.
Centrifugar a 4.000 rpm durante cinco minutos como mínimo. Diluir a continuación con metanol al 50 por 100 (47.3.9) para obtener una concentración aproximada en monensina sódica de 8 microgramos/ml (U).
47.4.4 Soluciones del extracto. Preparar, a partir de la solución U y por diluciones sucesivas (1 + 1) con metanol al 50 por 100 (47.3.9) las soluciones cuyas concentraciones supuestas sean U (4 microgramos/ml), U (2 microgramos/ml) y U (1 microgramo/ml).
47.4.5 Modalidades de la determinación. Sembrar a 50-60 ºC el medio de cultivo base para la determinación (47.3.5) con la suspensión de las esporas (47.3.3). Mediante ensayos preliminares sobre placas con el medio (47.3.5), determinar la cantidad de inóculo que permite obtener las zonas de inhibición más amplias y que además sean nítidas para las diferentes concentraciones de monensina sódica.
47.4.6 Preparación de las placas. La difusión sobre agar se efectúa en las placas con las cuatro concentraciones de la solución patrón (S, S, S y S) y las cuatro concentraciones del extracto (U, U, U y U). Cada placa debe necesariamente recibir las cuatro concentraciones de patrón y de extracto. A tal efecto, es necesario escoger la dimensión de las placas para que se puedan practicar en el medio de agar por lo menos 8 cavidades de 10 a 13 mm de diámetro, cuyos centros no disten entre sí menos de 30 mm. Pueden utilizarse como placas, láminas planas de vidrio, coronadas por un anillo de aluminio o de plástico de 200 mm de diámetro y 20 mm de altura.
Introducir en las placas una cantidad del medio (47.3.5), sembrado como indica (47.4.5), de forma que se obtenga una capa de unos 2 mm de espesor (60 ml para una placa de 200 mm de diámetro). Dejar solidificar, abrir las cavidades y depositar volúmenes exactamente medidos de soluciones patrón y extracto (0,10 a 0,15 ml por cavidad, según diámetro). Efectuar como mínimo cuatro repeticiones de cada concentración, de modo que cada determinación sea objeto de una evaluación de 32 zonas de inhibición.
47.4.7 Incubación. Incubar las nueve placas durante dieciocho horas aproximadamente a 35 - 37 ºC.
47.5 Cálculos.
Medir el diámetro de las zonas de inhibición con una precisión de 0,1 mm. Para cada concentración, anotar los valores medios en papel semilogarítmico representando el logaritmo de las concentraciones frente al diámetro de las zonas de inhibición. Trazar las rectas más ajustadas para la solución patrón y para el extracto procediendo, por ejemplo, como sigue:
Determinar el punto más apropiado del nivel más bajo de la solución patrón (SL) mediante la fórmula:
(a) SL = 7S + 4S + S - 2S
10
Determinar el punto más apropiado del nivel más alto de la solución de referencia (SH) con ayuda de la fórmula:
(b) SH = 7S + 4S + S - 2S
10
Determinar igualmente los puntos más apropiados del extracto para el nivel más bajo (UL) y el nivel más alto (UH) sustituyendo S, S, S y S por U, U, U y U en las fórmulas anteriores.
Inscribir los valores SL y SH sobre la misma gráfica. Uniendo los dos puntos se obtiene la recta más ajustada para la solución patrón. Procediendo de la misma forma para UL y UH se obtiene la recta más ajustada para el extracto.
En ausencia de interferencias, las rectas deberían ser paralelas. En la práctica se las considera paralelas cuando SH-SL y UH-UL no difieren más del 10 por 100 de su media.
Si las rectas no son paralelas, puede eliminarse U y S o U y S. Los valores SL, SH, UL y UH que permiten obtener las rectas más ajustadas se calculan mediante las siguientes fórmulas:
5S + 2S - S 5S + 2S - S
(a) SL = ----------- o -----------
6 6
5S + 2S - S 5S + 2S - S
(b) SH = ----------- o -----------
6 6
y con fórmulas análogas para UL y UH. La utilización de esta alternativa impone que se respeten los mismos criterios de paralelismo. La obtención de un resultado procedente de tres niveles debe ser mencionada en el boletín de análisis.
Una vez consideradas las rectas paralelas, calcular el logaritmo de la actividad relativa (log. A) mediante una de las siguientes fórmulas:
Para 4 niveles:
(c) log A = (U + U + U + U - S - S - S - S) x 0,602
U + U + S + S - U - U - S - S
Para 3 niveles:
(d) log A = (U + U + U - S - S - S) x 0,401
U + S - U - S
(d') log A = (U + U + U - S - S - S) x 0,401
U + S - U - S
La actividad real = actividad supuesta x actividad relativa.
Si la actividad relativa es inferior a los valores comprendidos entre 0,5 y 2,0, repetir la determinación efectuando los ajustes apropiados de las concentraciones del extracto o si es necesario, de las soluciones patrón. Si la actividad no puede llevarse entre los dos valores anteriores, el resultado debe considerarse aproximado y éste debe señalarse en el boletín de análisis.
Si las rectas se consideran que no son paralelas, repetir la determinación. Si no se consigue el paralelismo, la determinación debe considerarse insatisfactoria.
La diferencia entre resultados de dos determinaciones efectuadas sobre la misma muestra por la misma persona no debe exceder de:
- 20 por 100 del resultado más elevado para contenidos en monensina sódica entre 10 y 25 mg/kg.
- 5 mg/kg, en valor absoluto, para los contenidos entre 25 y 50 mg/kg.
- 10 por 100 del resultado más elevado para contenidos superiores a 50 mg/kg.
47.6 Observaciones.
47.6.1 Pueden utilizarse otros métodos en la medida que esté probado que producen suspensiones de esporas análogas.
47.6.2 Puede utilizarse todo medio de cultivo comercial de composición parecida y que dé los mismos resultados.
47.7 Referencias. Novena Directiva de la Comisión de 31 de julio de 1981, 81/715/CEE. «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 257/9, del 10 de septiembre de 1981.
48. Avoparcina
(Por difusión sobre agar)
48.1 Principio. El método permite la determinación de avoparcina en piensos y premezclas. El límite inferior de detección es de 2 mg/kg. Los antibióticos polieteres interfieren en la determinación.
La muestra se somete a una extracción con una mezcla de acetona/agua/ácido clorhídrico. La actividad antibiótica del extracto se determina midiendo la difusión de la avoparcina en un medio de agar, sembrado con Bacillus subtilis. La difusión se manifiesta por la formación de zonas de inhibición de microorganismo. El diámetro de estas zonas se considera directamente proporcional al logaritmo de la concentración de antibiótico para la gama de concentraciones utilizadas.
48.2 Reactivos.
48.2.1 Microorganismo. Bacillus subtilis ATCC 6633 (NCIB 8054).
48.2.2 Conservación de la cepa. Sembrar el medio de cultivo (48.2.4), en tubos inclinados, con Bacillus subtilis. Incubar durante una noche a 30 ºC, conservar en refrigerador a 4 ºC aproximadamente y renovar la siembra todos los meses.
48.2.3 Preparación de la suspensión de esporas. (Ver 48.5.1). Recoger los gérmenes de un tubo de agar (48.2.2) de reciente preparación, con ayuda de 2 ó 3 ml de agua estéril. Sembrar con esta suspensión 300 ml del medio de cultivo (48.2.4) en un frasco de Roux e incubar de tres a cinco días a 30 ºC. Después de controlar la esporulación al microscopio, recoger las esporas con 15 ml de etanol (48.2.5) y homogeneizar. Esta suspensión puede conservarse hasta cinco meses a 4 ºC aproximadamente.
48.2.4 Medio de mantenimiento de la cepa (48.5.2).
Peptona: 6,0 g.
Triptona: 4,0 g.
Extracto de levadura: 3,0 g.
Extracto de carne: 1,5 g.
Glucosa: 1,0 g.
Agar: 15,0 g.
Agua: 1.000 ml.
pH: 6,5 (después de esterilizar).
48.2.5 Etanol al 20 por 100 (v/v). Diluir 200 ml de etanol con 800 ml de agua.
48.2.6 Acido clorhídrico, d = 1,18 - 1,19.
48.2.7 Solución de hidróxido de sodio 2 M.
48.2.8 Tampón fosfato 0,1 M. Pesar 13,6 g de dihidrógeno fosfato de potasio (KHPO) y diluir hasta 1.000 ml con agua y ajustar a pH 4,5.
48.2.9 Mezcla acetona/agua/ácido clorhídrico (48.2.6): 65/32,5/2,5 (v/v/v).
48.2.10 Sustancia patrón. Sulfato de avoparcina de actividad conocida.
48.2.11 Solución patrón. Disolver 10 mg, exactamente pesados, de sustancia patrón (48.2.10) en tampón fosfato (48.2.8) y diluir con este tampón para obtener una solución patrón de avoparcina de 100 microgramos/ml. Conservar en frasco tapado a 4 ºC como máximo siete días.
48.2.12 Soluciones patrón para las premezclas. Preparar a partir de la solución (48.2.11) y por diluciones sucesivas con tampón fosfato (48.2.8) las siguientes soluciones:
S: 4 microgramos/ml.
S: 2 microgramos/ml.
S: 1 microgramo/ml.
S: 0,5 microgramo/ml.
48.2.13 Soluciones patrones para los piensos. Preparar a partir de la solución (42.2.11) y por diluciones sucesivas con tampón fosfato (48.2.8) las siguientes soluciones:
S: 2 microgramos/ml.
S: 1 microgramo/ml.
S: 0,5 microgramos/ml.
S: 0,25 microgramo/ml.
48.3 Procedimiento.
48.3.1 Preparación del extracto y de las soluciones. Premezclas. Pesar, con precisión de 10 mg, una cantidad de muestra que contenga de 10 a 100 mg de avoparcina, trasferir a matraz aforado de 100 ml, añadir 60 ml de mezcla (48.2.9)y agitar durante quince minutos con agitador mecánico. Verificar el pH y ajustarlo a pH = 2, si es necesario, con ácido clorhídrico (48.2.6). Completar al volumen con la mezcla (48.2.9) y homogeneizar. Filtrar una parte sobre papel Whatman número 1 o similar y eliminar los primeros 5 ml. Tomar una alícuota y ajustar el pH a 4,5 con solución de hidróxido de sodio (48.2.7). Diluir esta solución con tampón fosfato (48.2.8) para obtener una concentración presumible de 4 microgramos/ml (U) de avoparcina.
Preparar a partir de esta solución y por diluciones sucesivas (1 + 1) con tampón fosfato (48.2.8), las soluciones supuestas U (2 microgramos/ml), U (1 microgramo/ml) y U (0,5 microgramos/ml). 48.3.2 Preparación del extracto y de las soluciones. Piensos. Pesar una cantidad de muestra de 50 g, añadir 100 ml de mezcla (48.2.9) y agitar durante treinta minutos con agitador mecánico. Clarificar por centrifugación el extracto (en tubos tapados), tomar una alícuota del extracto limpio (ver tabla) y ajustar a pH 4,5 con solución de hidróxido de sodio (48.2.7). Diluir esta solución con tampón fosfato (48.4.8) para obtener la solución U (ver tabla).
TABLA
Contenido supuesto en avoparcina (mg/kg) / 5 / 7,5 / 10 / 15 / 20 / 40
Peso de muestra en g (± 0,1 g) / 50 / 50 / 50 / 50 / 50 / 50
Volumen de mezcla (ml) (48.2.9) / 100 / 100 / 100 / 100 / 100 / 100
Volumen de extracto limpio (ml) / 20 / 15 / 20 / 15 / 20 / 10
Volumen final (ml): U / 25 / 25 / 50 / 50 / 100 / 100
Concentración supuesta U en microgramos/ml. / 2 / 2
aprox. / 2 / 2
aprox. / 2 / 2
Preparar a partir de esta solución y por diluciones sucesivas (1 + 1) con tampón fosfato (48.2.8) las soluciones supuestas U (1,0 microgramo/ml), U (0,5 microgramos/ml), U (0,25 microgramos/ml).
48.3.3 Determinación. Inoculación del medio de cultivo. Sembrar a 50-60 ºC el medio base de la determinación (48.2.4) con la suspensión de esporas (48.2.3). Mediante ensayos preliminares sobre placas con el medio (48.2.4), determinar la cantidad de inóculo que permita obtener las zonas de inhibición más amplias y que además sean nítidas, para las diferentes concentraciones de avoparcina.
48.3.4 Determinación. Preparación de las placas. La difusión sobre agar se efectúa en placas con las cuatro concentraciones de la solución patrón (S, S, S y S) y las cuatro concentraciones del extracto (U, U, U y U).
Cada placa debe necesariamente recibir las cuatro concentraciones de patrón y extracto. A tal efecto, escoger las dimensiones de las placas de forma que se puedan practicar en el medio agar por lo menos ocho cavidades de 10 a 13 mm de diámetro, cuyos centros no disten entre sí menos de 30 mm. Pueden utilizarse como placas, láminas planas de vidrio, coronadas de un anillo de aluminio o de materia plástica de 200 mm de diámetro y de 20 mm de altura.
Introducir en las placas una cantidad del medio (48.2.4), sembrado como indica en (48.3.3), que permita obtener una capa aproximadamente de 2 mm de espesor (60 ml para una placa de 200 mm de diámetro). Dejar solidificar, abrir las cavidades y depositar volúmenes exactamente medidos de soluciones patrón y extracto (0,10 a 0,15 ml por cavidad, según el diámetro). Efectuar como mínimo cuatro repeticiones de cada concentración, de modo que cada determinación sea objeto de una evaluación de 32 zonas de inhibición.
48.3.5 Incubación. Incubar las placas entre dieciséis y dieciocho horas a 30 ºC.
48.4 Cálculos. Medir el diámetro de las zonas de inhibición con una precisión de 0,1 mm. Para cada concentración, registrar las medidas medias sobre papel semi-logarítmico, representando el logaritmo de las concentraciones frente a los diámetros de las zonas de inhibición. Trazar las rectas más ajustadas para la solución patrón y para el extracto procediendo, por ejemplo, como sigue:
Determinar el punto más apropiado del nivel más bajo de la solución patrón (SL) mediante la fórmula:
(a) SL = 7S + 4S + S - 2S
(a) SL =
10
Determinar el punto más apropiado del nivel más alto de la solución patrón (SH) mediante la fórmula:
(b) SH = 7S + 4S + S - 2S
(b) SH =
10
Determinar de igual forma los puntos más apropiados del extracto para el nivel más bajo (UL) y el nivel más alto (UH) sustituyendo S, S, S y S en las fórmulas por U, U, U y U.
Llevar los valores SL y SH sobre la misma gráfica. Uniendo los dos puntos se obtiene la recta más ajustada para la solución patrón. Procediendo del mismo modo para UL y UH se obtiene la recta más ajustada para el extracto.
En ausencia de toda interferencia, las rectas deberían ser paralelas cuando SH-SL y UH-UL no difieren más del 10 por 100 de su media.
Si las rectas no son paralelas, se puede eliminar bien U y S o bien U y S. Los valores SL, SH, UL y UH que permiten obtener las rectas más ajustadas se calculan según:
5S + 2S - S 5S + 2S - S
(a') SL = ----------- o -----------
6 6
5S + 2S - S 5S + 2S - S
(b') SH = ----------- o -----------
6 6
y las fórmulas análogas para UL y UH. La utilización de esta alternativa impone que se respeten los mismos criterios de paralelismo. La obtención de un resultado procedente de tres niveles debe ser mencionada en el boletín de análisis.
Cuando las rectas se consideran paralelas, calcular el logaritmo de la actividad relativa (log A) como sigue:
Para 4 niveles:
(c) log A = (U + U + U + U - S - S - S - S) x 0,602
U + U + S + S - U - U - S - S
Para 3 niveles:
(d) log A = (U + U + U - S - S - S) x 0,401
U + S - U - S
(d) log A = (U + U + U - S - S - S) x 0,401
U + S - U - S
La actividad real = actividad supuesta x actividad relativa.
Si la actividad relativa se encuentra por debajo de los valores comprendidos entre 0,5 y 2,0, repetir la determinación procediendo a los ajustes apropiados de las concentraciones del extracto o, eventualmente, de las soluciones patrones. Si esta actividad no puede incluirse entre estos valores, el resultado debe considerarse aproximado y esto debe figurar en el boletín de análisis.
Cuando las rectas no se consideran paralelas, repetir la determinación. Si no se consigue el paralelismo, la determinación debe considerarse como insatisfactoria.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones efectuadas sobre la misma muestra por la misma persona no debe exceder de:
- 2 mg/kg, en valor absoluto, para los contenidos de avoparcina de 2 a 10 mg/kg.
- 20 por 100 del resultado más alto para contenidos entre 10 y 25 mg/kg.
- 5 mg/kg en valor absoluto, para contenidos entre 25 y 50 mg/kg.
- 10 por 100 del resultado más alto para contenidos superiores a 50 mg/kg.
48.5 Observaciones.
48.5.1 Pueden utilizarse otros métodos en la medida que estén comprobados que producen análogas suspensiones de esporas.
48.5.2 Puede utilizarse otro medio de cultivo comercial que tenga una composición análoga y dé los mismos resultados.
48.6 Referencias. Novena Directiva de la Comisión de 31 de julio de 1981. 81/715/CEE. «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 257/38, de 10 de septiembre de 1981.
49. Antibióticos del grupo de las tetraciclinas
49.1 Detección e identificación.
49.1.1 Principio. El método permite detectar e identificar los antibióticos del grupo de las tetraciclinas en los piensos que contengan al menos 0,1 mg/kg de ellas, en concentrados y en premezclas.
La muestra se somete a extracción mediante una mezcla de metanol y de ácido clorhídrico. El extracto se cromatografía sobre papel por vía ascendente comparativamente a sus soluciones de referencia. Los antibióticos se detectan e identifican en comparación con sus valores Rf con los de las sustancias patrón, sea por fluorescencia de luz UV (elevados contenidos en antibiótico), ya sea por medio de bioautografía sobre medio de agar sembrando con B. cereus.
49.1.2 Reactivos.
49.1.2.1 Tampón, pH 3,5. Acido cítrico monohidrato p.a.: 10,256 g.
Monohidrogenofosfato de sodio dihidrato (NaHPO.2HO) p.a.: 7,45 g.
Acetona p.a.: 300 ml.
Agua destilada: Hasta 1.000 ml.
49.1.2.2 Tampón fosfato: pH 5,5. Dihidrogenofosfato de potasio (KHPO) p.a.: 130,86 g.
Monohidrogenofosfato de sodio dihidrato (NaHPO.2HO) p.a.: 6,947 g.
Agua destilada: Hasta 1.000 ml.
49.1.2.3 Eluyente I: mezcla nitrometano p.a./cloroformo p.a./alfa diclorhidrina: 20/10/1,5 en volumen. Preparar en el momento de su empleo.
49.1.2.4 Eluyente II: Mezcla nitrometrano p.a./ cloroformo p.a./alfa picolinio (20/10/3 en volumen). Preparar en el momento de su empleo.
49.1.2.5 Mezcla netanol p.a./ácido clorhídrico (d = 1,98/2 en volumen).
49.1.2.6 Acido clorhídrico 0,1N.
49.1.2.7 Amoníaco, d = 0,91.
49.1.2.8 Sustancias patrón: clortetraciclina, oxitetraciclina, tetraciclina, cuya actividad se expresa en clorhidrato.
49.1.2.9 Microorganismo: B. cereus ATCC número 11.778. Mantenimiento de la cepa, preparación de la suspensión de esporas e inoculación del medio de cultivo. Aplicar las disposiciones (49.2.2.1) y (49.2.2.2) del método de determinación de la clorotetraciclina, de la oxitetraciclina y de la tetraciclina, por difusión sobre agar, objeto de la parte (49.2).
49.1.2.10 Medio de cultivo. (Ver 41.15.1):
Glucosa: 1 g.
Peptona trípsica: 10 g.
Extracto de carne: 1,5 g.
Extracto de levadura: 3 g.
Agar: 20 g.
Agua destilada: Hasta 1.000 ml.
Ajustar el pH a 5,8 en el momento de su empleo.
49.1.3 Material.
49.1.3.1 Equipo para cromatografía ascendente sobre papel, (altura del papel 25 cm). Papeles Schleicher y Schüll 20040 b o 20043 b o equivalente.
49.1.3.2 Centrífuga.
49.1.3.3 Estufa de incubación, regulada a 30 ºC.
49.1.3.4 Lámpara UV para detección de la fluorescencia.
49.1.3.5 Placas de vidrio de 20 x 30 cm aproximadamente que permitan el montaje de una caja plana para la bioautobiografía.
49.1.4 Procedimiento.
49.1.4.1 Soluciones de calibrado.
49.1.4.1.1 Soluciones patrón. Preparar a partir de las sustancias de calibrado (49.1.2.8) y con ayuda de ácido clorhídrico (49.1.2.6) unas soluciones cuya concentración corresponda respectivamente a 500 microgramos de clortetraciclina-HCl o de oxitetraciclina-HCl o de tetraciclina-HCl por ml.
49.1.4.1.2 Soluciones de referencia para la detección en luz UV. Diluir las soluciones (49.1.4.1.1) con tampón de fosfato (49.1.2.2) para obtener unas soluciones cuya concentración corresponda a 100 microgramos de clortetraciclina-HCl o de oxitetraciclina-HCl o de tetraciclina-HCl por ml.
49.1.4.1.3 Soluciones de referencia para la detección por bioautografía. Diluir las soluciones (49.1.4.1.1) con tampón fosfato (49.1.2.2) para obtener unas soluciones cuya concentración corresponda a 5 microgramos de clortetraciclina-HCl, o de oxitetraciclina-HCl o de tetraciclina-HCl por ml.
49.1.4.2 Extracción. Cuando el contenido supuesto del antibiótico sea inferior a 10 mg/kg, se podrá emplear la muestra homogeneizada o la fracción más fina separada mediante tamizado, dado que los antibióticos se encontrarán preferentemente en dicha fracción.
Poner la muestra en suspensión en la mezcla (49.1.2.5) y centrifugar. Recoger el líquido sobrenadante para emplearlo tal como esté o diluirlo, si fuera necesario, por medio de la mezcla (49.1.2.5) para obtener unas concentraciones de antibiótico de 100 microgramos/ml (49.1.4.2.1) y de 5 microgramos/ml (49.1.4.2.2) aproximadamente.
49.1.4.3 Detección e identificación.
49.1.4.3.1 Cromatografía. Sumergir el papel en la solución tampón, pH 3,5 (49.1.2.1). Eliminar el exceso de líquido comprimiendo el papel entre unas hojas de papel de filtro seco. Depositar a continuación sobre el papel unos volúmenes de 0,01 ml de las soluciones de referencia (49.1.4.1.2 y 49.1.4.1.3) y del extracto (49.1.4.2 y 48.1.4.2.2). Para obtener una buena sepración, el contenido apropiado en humedad del papel es determinante; en su caso, dejar secar ligeramente.
Desarrollar por cromatografía ascendente. Emplear el eluyente I (49.1.2.3) para la detección por bioautografía, el eluyente II (49.1.2.4) para la detección en luz UV. Cuando el frente del disolvente alcance de 15 a 20 cm de alto (aproximadamente una hora treinta minutos) interrumpir la cromatografía y secar el papel.
49.1.4.3.2 Detección de luz ultravioleta. Cuando el contenido en antibiótico sea superior a 1 microgramo/cm, se pueden percibir manchas fluorescentes amarillas o por irradiación bajo la lámpara de UV (49.1.3.4) previo tratamiento del cromatograma mediante vapores amoniacales (49.1.2.7).
49.1.4.3.3 Detección por bioautografía. Verter el medio de cultivo (49.1.2.10) previamente sembrado con B. cereus (49.1.2.9) sobre unas placas de vidrio (49.1.3.5) y colocar el papel sobre el medio de cultivo. Tras cinco minutos de contacto, apartar el papel y colocarlo sobre un lugar distinto del medio de cultivo donde se le mantendrá durante el período de incubación, incubar durante una noche en estufa a 30 ºC. La presencia de un antibiótico del grupo de las tetraciclinas se marca por zonas de inhibición claras en el medio de cultivo turbio.
Para fijar el cromatograma, vaporizar la solución (49.1.2.11) sobre el papel, previa incubación.
49.1.4.3.4 Identificación. Los valores RF relativos a los antibióticos del grupo de tetraciclinas se dan a continuación. Dichos valores podrán variar ligeramente según la calidad del papel y su contenido en humedad:
Clortetraciclina (CTC): 0,60.
Tetraciclina (TC): 0,40.
Oxitetraciclina (OTC): 0,20.
4 - epi - CTC: 0,15.
4 - epi - TC: 0,13.
4 - epi - OTC: 0,10.
Los compuestos «epi» tienen una actividad antibiótica inferior a la de los compuestos normales.
49.1.5 Observaciones.
49.1.5.1 Podrá ser empleado cualquier medio de cultivo comercial de composición análoga y que dé los mismos resultados.
49.2 Clortetraciclina, oxitetraciclina y tetraciclina.
49.2.A Por difusión sobre agar.
49.2.A.1 Principio. El método permite determinar la clortetraciclina, (CTC), la oxitetraciclina (OTC) y la tetraciclina (TC) en los piensos, concentrados y premezclas. El límite inferior de la determinación es de 5 mg/kg. Los contenidos inferiores a 5 mg/kg pueden estimarse por interpolación gráfica.
Para los contenidos iguales o inferiores a 50 mg/kg, la muestra se someterá a extracción por formanida diluida. Para los contenidos superiores a 50 mg/kg, se somete a extracción mediante una mezcla de acetona, de agua y de ácido clorhídrico para la determinación de la CTC, y por una mezcla de metanol y de ácido clorhídrico para la determinación de la OTC y de la TC.
Los extractos se diluirán a continuación y su actividad antibiótica se determinará por la medida de la difusión de la CTC o de la OTC o de la TC en medio a agar sembrado con B. cereus. La difusión se indica por la formación de zonas de inhibición en presencia del microorganismo. El diámetro de dichas zonas es directamente proporcional al logaritmo de la concentración de antibiótico.
49.2.A.2 Reactivos.
49.2.A.2.1 Microorganismos: B. cereus ATCC número 11.778.
49.2.A.2.1.1 Mantenimiento de la cepa. Sembrar B. cereus en tubo de agar inclinado constituido por el medio de cultivo (49.2.A.3.1) exento de azul de metileno y de ácido bórico. Incubar durante una noche a 30 ºC aproximadamente. Conservar el cultivo en refrigerador y resembrar cada catorce días sobre agar inclinado.
49.2.A.2.1.2 Preparación de la suspensión de esporas. Recoger los gérmenes de un tubo de agar inclinado (49.2.A.2.1.1) con ayuda de 2 a 3 ml de suero fisiológico (49.2.A.2.2.5). Sembrar con dicha suspensión un frasco de Roux que contenga 300 ml del medio de cultivo (49.2.A.2.2.1), exento de azul de metileno y de ácido bórico, cuya concentración en agar sea del 3 al 4 por 100. Incubar tres a cinco días a 28-30 ºC, recoger a continuación las esporas en 15 ml de etanol (49.2.A.2.2.6), tras haber comprobado la esporulación bajo el microscopio, y homogeneizar. Dicha suspensión puede conservarse en refrigerador 5 meses al menos.
Por unos ensayos preliminares sobre placas con el medio de base de la determinación (49.2.A.2.2.1), determinar la cantidad de inóculo que permita obtener para las diferentes concentraciones de antibiótico empleadas, unas zonas de inhibición tan extensas como sea posible, y que sean claras. Dicha cantidad es generalmente de 0,2 a 0,3 ml/1.000 ml. La siembra del medio de cultivo se realiza entre 50 y 60 ºC.
49.2.A.2.2 Medios de cultivo y reactivos.
49.2.A.2.2.1. Medio de base de la determinación (ver 49.2.A.5.1):
Glucosa: 1 g.
Peptona tríptica: 10 g.
Extracto de carne: 1,5 g.
Extracto de levadura: 3 g.
Agar, según calidad: 10 a 20 g.
Tween 80: 1 ml.
Tampón fosfato, pH 5,5 (49.2.A.2.2.2): 10 ml.
Solución al 5 por 100 (p/v) de ácido bórico: 15 ml.
Solución etanólica al 0,5 por 100 de azul de metileno: 4 ml.
Agua destilada: Hasta 1.000 ml.
Ajustar a pH 5,8 antes de su empleo.
49.2.A.2.2.2 Tampón fosfato pH 5,5. Dihidrógeno-fosfato de potasio (KHPO) p.a.: 130,86 g.
Monohidrógeno-fosfato de sodio dihidrato (NaHPO.2HO) p.a.: 6,947 g.
Agua destilada: Hasta 1.000 ml.
49.2.A.2.2.3 Tampón fosfato, pH 5,5, diluido al 1/10.
49.2.A.2.2.4 Tampón fosfato, pH 8. Dihidrógeno-fosfato de potasio (KHPO) p.a.: 1,407 g.
Monohidrógeno-fosfato de sodio dihidrato (NaHPO.2HO) p.a.: 57,539 g.
Agua destilada: Hasta 1.000 ml.
49.2.A.2.2.5 Suero fisiológico estéril.
49.2.A.2.2.6 Etanol a 20 por 100 (v/v).
49.2.A.2.2.7 Acido clorhídrico 0,1N.
49.2.A.2.2.8 Formamida al 70 por 100 (v/v). Preparar en fresco antes del empleo y ajustar el pH 4,5 con ayuda de ácido sulfúrico 2N aproximadamente.
49.2.A.2.2.9 Mezcla acetona p.a./agua/ácido clorhídrico (d = 1,19) (65/33/2 en volumen).
49.2.A.2.2.10 Mezcla metanol p.a./ácido clohídrico (d = 1,19) (98/2 v/v).
49.2.A.2.2.11 Sustancias patrones: CTC, OTC, TC cuya actividad se expresa en clorhidrato.
49.2.A.3 Procedimiento.
49.2.A.3.1 Soluciones patrones.
49.2.A.3.1.1 Clortetraciclina. Preparar a partir de la sustancia patrón (49.2.A.2.2.11) y con la ayuda de ácido clorhídrico (49.2.A.2.2.7), una solución patrón cuya concentración corresponda a 500 microgramos/ml de clortetraciclina-HCl. Dicha solución se conserva una semana en refrigerador.
A partir de dicha solución patrón preparar una solución de calibrado de trabajo S8 cuya concentración corresponda a 0,2 microgramos/ml de clortetraciclina-HCl. La dilución se hace con la ayuda del tampón fosfato, pH 5,5 diluido al 1/10 (49.2.A.2.2.3), con adicción del 0,01 por 100 de negro amido (ver 49.2.A.5.2).
Preparar a continuación por sucesivas diluciones (1+1) con ayuda del tampón (49.2.A.2.2.3), las concentraciones siguientes:
S: 0,1 microgramos/ml.
S: 0,05 microgramos/ml.
S: 0,025 microgramos/ml.
49.2.A.3.1.2 Oxitetraciclina. Procediendo como se indica en (49.2.A.3. 1.1) preparar, a partir de una solución patrón cuya concentración corresponde a 400 microgramos/ml de oxitetraciclina-HCl, una solución patrón de trabajo S8 de 1,6 microgramos/ml de oxitetraciclina-HCl y las concentraciones siguientes:
S: 0,8 microgramos/ml.
S: 0,4 microgramos/ml.
S: 0,2 microgramos/ml.
49.2.A.3.1.3 Tetraciclina. Procediendo tal como se indica en (49.2.A.3.1.1), preparar, a partir de una solución patrón cuya concentración correponda a 500 microgramos/ml de tetraciclina-HCl, una solución patrón de trabajo S8 de 1,0 microgramos/ml de tetraciclina-HCl y las siguientes concentraciones:
S: 0,5 microgramos/ml.
S: 0,25 microgramos/ml.
S: 0,125 microgramos/ml.
49.2.A.3.2 Extracción.
49.2.A.3.2.1 Contenidos iguales o inferiores a 50 mg/kg. Tratar la muestra por la formamida (49.2.A.2.2.8), según las indicaciones que se dan a continuación en el cuadro. Agitar durante 30 minutos en agitador. Diluir inmediatamente después con ayuda del tampón fosfato (49.2.A.2.3), según las indicaciones dadas a continuación en el cuadro, para obtener la concentración U. La concentración de formamida en dicha solución no debe exceder del 40 por 100. Centrifugar o dejar decantar de manera que se obtenga una solución límpida.
Preparar a continuación las concentraciones U, U y U, por diluciones sucesivas (1+1) con ayuda del tampón fosfato (49.2.A.2.3).
Antibiótico / CTC / DTC / TC
Contenido supuesto en mg/kg. / 10 / 50 / 10 / 50 / 10 / 50
Muestra en g. / 10 / 10 / 24 / 9,6 / 20 / 10
Ml de formamida (49.2.A.2.2.8). / 100 / 100 / 80 / 100 / 80 / 100
dil / dil / / / / dil
Ml de tampón fosfato (49.2.A.2.2.3). / 1/5 / 1/25 / 70 / 200 / 120 / 1/5
(a) / (b) / / / / (a)
Concentración U en microgramos/ml. / 0,2 / 0,2 / 1,6 / 1,6 / 1,0 / 1,0
(a) Tomar 20 ml de extracto y completar a 100 ml con el tampón en un matraz aforado.
(b) Tomar 4 ml de extracto y completar a 100 ml con el tampón en un matraz aforado.
49.2.A.3.2.2 Contenidos superiores a 50 mg/kg.
49.2.A.3.2.2.1 Clortetraciclina. Tratar, según el contenido supuesto de antibiótico de la muestra o su garantía de fabricación, una muestra de 1 a 10 gramos, por 20 veces su volumen con la mezcla (49.2.A.2.2). Agitar durante treinta minutos con agitador.
Comprobar que el pH permanece por debajo de 3 a lo largo de la extracción; si fuera necesario ajustar a pH 3 (para los compuestos minerales, con ayuda de ácido acético al 10 por 100). Tomar una parte alícuota del extracto y ajustar el pH a 5,5 con ayuda del tampón fosfato, pH 8 (49.2.A.2.2.4), en presencia del verde la bromocresol (viraje del amarillo al azul). Diluir con ayuda del tampón fosfato, pH 5,5, diluido a 1/10 (49.2.A.2.2.3) para obtener la concentración U (49.2.A.3.2.1).
Preparar seguidamente las concentraciones U, U y U por diluciones sucesivas (1+1) con ayuda del tampón fosfato (49.2.A.2.2.3).
49.2.A.3.2.2.2 Oxitetraciclina y tetraciclina. Proceder como se indica en (49.2.A.3.2.2.2) sustituyendo la mezcla (49.2.A.2.2) por la mezcla (49.2.A.2.2.10).
49.2.A.3.3 Modalidades de la determinación.
49.2.A.3.3.1 Siembra del medio de cultivo. Sembrar a 50-60 ºC el medio de base para la determinación (49.2.A.2.2.1) con la suspensión de esporas (49.2.A.2.1.2).
49.2.A.3.3.2 Preparación de las cajas. La difusión sobre agar se efectúa en cajas, con las cuatro concentraciones patrón (S, S, S y S) y las cuatro concentraciones del extracto (U, U, U y U). Cada caja debe recibir necesariamente las cuatro concentraciones del patrón y del extracto.
A tal fin, escoger las dimensiones de las cajas de tal forma que se pueda practicar en el medio gelosado al menos 8 cavidades de 10 a 13 mm de diámetro. Calcular la cantidad de medio de cultivo inoculado (49.2.A.3.3.1), que habrá de utilizarse de forma que se pueda obtener un recubrimiento uniforme de 2 mm aproximadamente de espesor. Es preferible emplear como cajas unas placas de vidrio planas provistas de un anillo de aluminio o de material plástico perfectamente plano, de 200 mm de diámetro y 20 mm de altura.
Introducir mediante la pipeta en las cavidades unas cantidades de solución de antibiótico, exactamente medidas, comprendidas entre 0,10 y 0,15 ml, según el diámetro.
Para cada muestra hacer al menos cuatro repeticiones de difusión con cada concentración, de forma que cada determinación sea objeto de una evaluación de 32 zonas de inhibición.
49.2.A.3.3.3 Incubación. Incubar las cajas durante dieciocho horas aproximadamente a 28-30 ºC.
49.2.A.4 Cálculos. Medir el diámetro de las zonas de inbición, preferentemente por proyección. Registrar las medidas sobre papel semilogarítmico, representando el logaritmo de las concentraciones frente a los diámetros de las zonzas de inhibición. Trazar las rectas de la solución de calibrado y del extracto. A falta de interferencias, las dos rectas deberán ser paralelas.
El logaritmo de la actividad relativa se calcula por la siguiente forma:
(U + U + U + U - S - S - S - S) x 0.602
U + U + U + U - S - S - S - S) x 0.602
U + U + S + S - U - U - S - S
Actividad real = actividad supuesta x actividad relativa.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe exceder del 10 por 100 en valor relativo.
49.2.A.5 Observaciones.
49.2.A.5.1 Podrá emplearse cualquier medio de cultivo comercial de análoga composición y que dé los mismos resultados.
49.2.A.5.2 El negro amido sirve para caracterizar las zonas de inhibición de las soluciones de calibrado (anillos azules).
49.2.B Por turbidimetría.
49.2.B.1 Principio. El método permite determinar la clortetraciclina (CTC), la oxitetraciclina (OTC) y la tetraciclina (TC) en las concentraciones superiores a 1 g/kg, en la medida en que ninguna otra sustancia interfiera, dando lugar a unos extractos turbios. Dicho método es más rápido que el método por difusión sobre agar.
La muestra se somete a extracción por mezcla de acetona, agua y ácido clorhídrico para la determinación de la CTC, y por una mezcla de metanol y de ácido clorhídrico para la determinación de la OTC y de la TC.
Los extractos se diluyen a continuación y su efecto antibiótico se determina por la medida de la transmisión luminosa de un medio de cultivo sembrado con Staphylococcus aureus y con antibiótico añadido. La transmisión luminosa es función de la concentración del antibiótico.
49.2.B.2 Reactivos.
49.2.B.2.1 Microorganismo: Staphylococcus aureus K 141. Ver (49.2.B.5.1).
49.2.B.2.1.1 Mantenimiento de la cepa. Sembrar S. aureus sobre tubo de agar inclinado constituido por el medio de cultivo (49.2.B.2.2.1), adicionado de 1,5 a 3 por 100 (según la calidad). Incubar durante una noche a 37 ºC. Conservar el cultivo en refrigerador y resembrar cuatro semanas sobre agar inclinado. Preparar simultáneamente unos subcultivos para el empleo de laboratorio.
49.2.B.2.1.2 Preparación del inocuo. Veinticuatro horas antes de su empleo, resembrar un subcultivo sobre agar inclinado e incubar durante una noche a 37 ºC. Poner en suspensión la totalidad del cultivo de un tubo de agar en 2 ml aproximadamente del medio de base (49.2.B.2.2.1) y trasvasar a continuación la suspensión en unas condiciones estériles en 100 ml aproximadamente del mismo medio de base (49.2.B.2.2.1). Incubar en baño de agua a 37 ºC hasta que el crecimiento de la cepa entre en su fase logarítmica (una hora treinta minutos a dos horas).
49.2.B.2.2 Medios de cultivo y reactivos.
49.2.B.2.2.1 Medio de base de la determinación. (Ver 49.2.B.5.2.)
Peptona: 5 g.
Extracto de levadura: 1,5 g.
Extracto de carne: 1,5 g.
Cloruro de sodio: 3,5 g.
Glucosa: 1 g.
Dihidrógeno-fosfato de potasio (KHPO) p.a.: 1,32 g.
Monohidrógeno-fosfato de potasio (KHPO) p.a.: 3,68 g.
Agua destilada: Hasta 1.000 ml.
pH tras esterilizar: 6,8 a 7.
49.2.B.2.2.2 Tampón fosfato pH 4,5. Dihidrógeno-fosfato de potasio (KHPO) p.a.: 13,6 g.
Agua destilada: Hasta 1.000 ml.
49.2.B.2.2.3 Acido clorhídrico 0,1N.
49.2.B.2.2.4 Mezcla acetona p.a./agua/ácido clorhídrico (d = 1,19) (65/33/2 en volumen).
49.2.B.2.2.5 Mezcla metanol p.a./ácido clorhídrico (d = 1,19) (98/2 en volumen).
49.2.B.2.2.6 Solución al 10 por 100 aproximadamente (p/v) de formaldehído.
49.2.B.2.2.7 Sustancias patrón: OTC, CTC, CT, cuya actividad se exprese en clorhidrato.
49.2.B.2.3 Solución patrón. Preparar, a partir de la sustancia patrón (49.2.B.2.2.7) y con ayuda de ácido clorhídrico (49.2.B.2.2.3) una solución patrón cuya concentración tenga 400 a 500 microgramos/ml de CTC-HCI, OTC-HCI o TC-HCI. Dicha solución se conserva una semana en refrigerador.
49.2.B.3 Procedimiento.
49.2.B.3.1 Extracción.
49.2.B.3.1.1 Clortetraciclina. Introducir en un matraz aforado de 200 ó 250 ml, una muestra de 1 a 2 gramos. Añadir 100 ml aproximadamente de la mezcla (49.2.B.2.2.4) y agitar durante treinta minutos con agitador. Completar el volumen con el tampón fosfato, pH 4,5 (49.2.B.2.2.2). Homogeneizar y dejar que se deposite.
49.2.B.3.1.2 Oxitetraciclina y tetraciclina. Introducir en un matraz aforado de 200 a 250 ml una muestra de 1 a 2 gramos. Añadir 100 ml aproximadamente de la mezcla (49.2.B.2.2.5) y agitar durante treinta minutos con agitador. Completar el volumen por el tampón de fosfato, pH 4,5 (49.2.B.2.2.2). Homogeneizar y dejar que se deposite.
49.2.B.3.2 Modalidades de determinación.
49.2.B.3.2.1 Preparación de series patrón y del extracto. Diluir de forma apropiada con ayuda del tampón de fosfato, pH 4,5 (49.2.B.2.2.2) la solución patrón (49.2.B.2.3) y el extracto (49.2.B.3.1), de forma que se obtengan una serie de concentraciones que permitan establecer, para cada determinación, una curva de calibrado, y la interpolación sobre dicha curva de al menos dos valores relativos al extracto. Las diluciones deben escogerse en función de las condiciones de crecimiento de la cepa, que pueden variar de un laboratorio a otro. Se procede genralmente de la siguiente forma: 49.2.B.3.2.1.1 Clortetraciclina. Diluir la solución patrón (49.2.B.2.3.) con ayuda del tampón fosfato (49.2.B.2.2.2) para obtener una solución patrón cuya concentración corresponde a 0,2 microgramos/ml de CTC-HCl. Preparar a continuación con ayuda de un tampón de fosfato (49.2.B.2.2.2), como se indica a continuación, y en unos tubos destinados a la determinación, 6 diluciones con una repetición de cada dilución.
Ml de solución de patrón de trabajo / Ml de tampón fosfato (49.2.B.2.2.2) / Concentración en CTC-HCl (x/ml)
0,7 / 0,3 / 0,14
0,6 / 0,4 / 0,12
0,55 / 0,45 / 0,11
0,45 / 0,55 / 0,09
0,4 / 0,6 / 0,08
0,3 / 0,7 / 0,06
Diluir el extracto (49.2.B.3.1.1) con ayuda del tampón de fosfato (49.2.B.2.2.2) para obtener una concentración supuesta en CTC-HCl de 0,12 microgramos/ml. Introducir 1 ml de dicha solución en dos tubos y 0,75 ml (= 0,09 microgramos) en otros dos tubos. Completar el volumen de los dos últimos tubos a 1 ml con el tampón de fosfato (49.2.B.2.2.2).
49.2.B.3.2.1.2 Oxitetraciclina y tetraciclina. Diluir la solución de calibrado (49.2.B.2.3) con ayuda del tampón de fosfato (49.2.B.2.2.2) para obtener una solución patrón de trabajo cuya concentración corresponda a 0,6 microgramos/ml de OTC-HCl o de TC-HCl. Preparar a continuación con ayuda del tampón fosfato (49.2.B.2.2.2) como se indica a continuación y en los tubos destinados a la determinación, 7 diluciones con una repetición de cada dilución.
Ml de solución de patrón de trabajo / Ml de tampón fosfato (49.2.B.2.2.2) / Concentración en CTC-HCl (x/ml)
0,9 / 0,1 / 0,54
0,8 / 0,2 / 0,48
0,7 / 0,3 / 0,42
0,6 / 0,4 / 0,36
0,4 / 0,6 / 0,24
0,3 / 0,7 / 0,18
0,2 / 0,8 / 0,12
Diluir el extracto (49.2.B.3.1.2) con el tampón de fosfato (49.2.B.2.2.2) para obtener una concentración supuesta en OTC-HCl o TC-HCl de 0,48 microgramos/ml. Introducir 1 ml de dicha solución en dos tubos y 0,5 ml (= 0,24 microgramos) en otros dos tubos. Completar el volumen de los dos últimos tubos a 1 ml por el tampón de fosfato (49.2.B.2.2.2).
49.2.B.3.2.2 Inoculación del medio de cultivo. Sembrar el medio de base de la determinación (49.B.2.2.1) con el inóculo (49.2.B.2.1.2) de forma que se pueda obtener mediante el fotómetro a 590 nm una transmisión luminosa del 85 por 100 en una cubeta de 5 cm o del 92 por 100 en una cubeta de 2 cm, estando el aparato regulado al 100 por 100 de transmisión sobre el medio de base (49.2.B.2.2.1) no inoculado.
49.2.B.3.2.3 Siembra. Introducir en cada tubo (49.2.B.3.2.1.1) o (49.2.B.3.2.1.2) 9 ml del medio de cultivo inoculado (49.2.B.3.2.2). La operación de relleno de los tubos deberá hacerse de modo adecuado, pero no necesariamente en condiciones estériles.
49.2.B.3.2.4 Incubación. La incubación debe hacerse obligatoriamente en un baño de agua cuya temperatura se mantenga homogénea a 37 ºC ± 0,1 ºC por agitación. El tiempo de incubación debe ser escogido de forma que se puedan trazar unas curvas de trasmisión cuya inclinación sea apropiada a unas medidas precisas (generalmente dos horas treinta minutos a tres horas). Bloquear a continuación el crecimiento introduciendo rápidamente 1 ml de solución de formaldehido (49.2.B.2.2.6) en cada tubo.
49.2.B.3.2.5 Medida del crecimiento. Medir las transmisiones mediante el fotómetro a 590 nm, regulando el aparato al 100 por 100 de trasmisión sobre la solución de calibrado más límpida (la que corresponda al contenido más elevado de antibiótico). Debido a las pequeñas diferencias de turbiedad presentadas por los distintos tubos, se recomienda utilizar cubetas de 2 cm al menos, y preferiblemente de 5 cm.
49.2.B.4 Cálculos. Trazar gráficamente la curva de calibrado sobre papel milimetrado, poniendo las transmisiones fotométricas en relación con las concentraciones de antibiótico. Interpolar sobre la curva las transmisiones relativas al extracto. Calcular el contenido en antibiótico de la muestra.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe exceder del 10 por 100, en valor relativo.
49.2.B.5 Observaciones.
49.2.B.5.1 Esta cepa, aislada por la LUFA en Kiel, acusa un crecimiento más rápido que el S. aureus ATCC 6538 P.
49.2.B.5.2 Puede emplearse cualquier medio de cultivo comercial de composición análoga y que dé los mismos resultados.
49.2.B.6 Referencias. Tercera Directiva de la Comisión de 27 de abril de 1972. 72/199/CEE. «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L, 123/6, de 29 de mayo de 1972.
50. Oleandomicina
(Por difusión sobre agar)
50.1 Principio. El método permite determinar la oleandomicina en los piensos, concentrados y premezclas, incluso en presencia de tetraciclinas. El límite inferior de la determinación es 0,5 mg/kg.
La muestra se somete a extracción por una solución metanólica diluida de tris (hidroximetil) aminometano. Previa centrifugación, el extracto se diluye y su actividad antibiótica se determina por la medida de la difusión de la oleandomicina en un medio de agar sembrado de B. cereus. La difusión estará indicada por la formación de zonas de inhibición en presencia del microorganismo. El diámetro de dichas zonas es directamente proporcional al logaritmo de la concentración del antibiótico.
50.2 Reactivos.
50.2.1 Microorganismo: B. cereus K 205 TR (ver 50.5.1) (resistente a las tetraciclinas).
50.2.1.1 Mantenimiento de la cepa. Sembrar B. cereus sobre agar en tubo inclinado con el medio de cultivo (50.3.2.2.1) con la adición de 100 microgramos de oxitetraciclina por 5 ml. Incubar durante una noche a 30 ºC aproximadamente. Conservar el cultivo en el refrigerador y resembrar cada cuatro semanas sobre agar inclinado.
50.2.1.2. Preparación de la suspensión de esporas. Recoger los gérmenes de un tubo de agar inclinado (50.2.1.1) con ayuda de 3 ml aproximadamente de suero fisiológico (50.2.2.3). Sembrar con dicha suspensión un frasco de Roux que contenga 300 ml del medio de cultivo (50.2.2.1) cuya concentración es del 3 al 4 por 100. Incubar tres a cinco días a 28-30 ºC, recoger a continuación las esporas en 15 ml de etanol (50.2.2.4), después de haber comprobado la esporulación bajo el microscopio, y homogeneizar. Dicha suspensión puede conservarse en el refrigerador al menos durante cinco meses.
Mediante ensayos previos sobre placas con el medio de base para la determinación (50.2.2.2) determinar la cantidad de inóculo que permita obtener para las distintas concentraciones de oleandomicina empleadas, unas zonas de inhibición tan extensas como sea posible y que sean claras. Dicha cantidad es generalmente de 0,1 a 0,2 ml/1.000 ml. La siembra del medio de cultivo se hará a 60 ºC.
50.2.2 Medios de cultivo y reactivos.
50.2.2.1 Medio de mantenimiento de la cepa (ver 50.5.2.)
Glucosa: 1 g.
Peptona trípsica: 10 g.
Extracto de carne: 1,5 g.
Extracto de levadura: 3 g.
Agar según la calidad: 10 a 20 g.
Agua destilada: Hasta 1.000 ml.
Ajustar el pH a 6,5 en el momento de su empleo.
50.2.2.2 Medio de base de la determinación (ver 50.5.2). Medio (50.2.2.1) ajustado a pH 8,8.
50.2.2.3 Suero fisiológico estéril.
50.2.2.4 Etanol al 20 por 100 (v/v).
50.2.2.5 Metanol p.a.
50.2.2.6 Solución al 0,5 por 100 (p/v) de tris (hidroximetil) amino metano p.a.
50.2.2.7 Solución de extracción.
Metanol puro: 50 ml.
Agua destilada: 50 ml.
Tris (hidroximetil) amino metano p.a.: 0,5 g.
50.2.2.8 Sustancia patrón: oleandomicina de actividad conocida.
50.3 Procedimiento.
50.3.1 Solución patrón. Disolver sustancia patrón (50.2.2.8) en 5 ml de metanol (50.2.2.5) y diluir con la solución (50.2.2.6) para obtener una concentración en oleandomicina de 100 microgramos/ml.
A partir de dicha solución patrón, preparar diluyendo mediante la solución (50.2.2.6) una solución patrón de trabajo S que contenga 0,1 microgramos/ml de oleandomicina.
Preparar a continuación por diluciones sucesivas (1+1) con ayuda de la solución (50.2.2.6) las siguientes concentraciones:
S: 0,05 microgramos/ml.
S: 0,025 microgramos/ml.
S: 0,0125 microgramos/ml.
50.3.2 Extracción. Tomar según el contenido supuesto de oleandomicina de la muestra, una cantidad de 2 a 10 gramos, añadir 100 ml de la solución (50.2.2.7) y agitar durante treinta minutos con agitador.
Centrifugar, tomar una alícuota del extracto y diluir mediante la solución (50.2.2.6) para obtener una concentración supuesta en oleandomicina de 0,1 microgramos/ml (U). Preparar a continuación las concentraciones U, U y U por diluciones sucesivas (1+1) con ayuda de la solución (50.2.2.6).
50.3.3. Modalidades de la determinación.
50.3.3.1. Siembra del medio de cultivo.
Sembrar a 60 ºC el medio de base de la determinación (50.2.2.2) con la suspensión de esporas (50.2.1.2).
50.3.3.2 Preparación de las cajas. La difusión sobre agar se verifica en unas cajas con las cuatro concentraciones de la solución de calibrado (S, S, S y S) y las cuatro concentraciones del extracto (U, U, U y U). Cada caja deberá recibir necesariamente las cuatro concentraciones de calibrado y del extracto.
A tal fin, escoger las dimensiones de las cajas de tal forma que se puedan efectuar en el medio gelosado al menos ocho cavidades de 10 a 13 mm de diámetro. Calcular la cantidad de medio de cultivo sembrado (50.3.3.1) que debe emplearse para obtener un recubrimiento uniforme de 2 mm aproximadamente de espesor. Es preferible emplear como cajas unas placas de vidrio planas provistas de un anillo de aluminio o de material plástico perfectamente plano de 200 mm de diámetro y de 20 mm de altura.
Introducir con la pipeta en las cavidades unas cantidades exactamente medidas de solución antibiótica comprendidas entre 0,10 y 0,15 ml según el diámetro.
Para cada muestra, hacer por lo menos cuatro repeticiones de difusión con cada concentración, de forma que cada determinación sea objeto de una evaluación de 32 zonas de inhibición.
50.3.3.3 Incubación. Incubar las cajas durante dieciocho horas aproximadamente a 28-30 ºC.
50.4 Cálculos. Medir el diámetro de las zonas de inhibición, preferentemente por proyección. Registrar las medidas sobre papel semilogarítmico, representando el logaritmo de las concentraciones frente a los diámetros de las zonas de inhibición. Trazar las rectas de la solución de calibrado y del extracto. A falta de interferencias, las dos rectas deben de ser paralelas.
El logaritmo de la actividad relativa se calculará por medio de la siguiente fórmula:
U + U + U + U - S - S - S - S) x 0.602
U + U + U + U - S - S - S - S) x0.602
U + U -S - S - U - U - S - S
Actividad real = actividad supuesta x actividad relativa.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe exceder del 10 por 100 en valor relativo.
50.5 Observaciones.
50.5.1 Cepa aislada por la LUFA en Kiel.
50.5.2 Puede ser empleado cualquier medio de cultivo comercial de composición análoga y que dé los mismos resultados.
50.6 Referencias. Tercera Directiva de la Comisión de 27 de abril de 1972. 72/199/CEE. «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L, 123/6, de 29 de mayo de 1972. Anexo II.
51. Amprolio
51.1 Principio. El método permite determinar el amprolio en los piensos, concentrados y premezclas. El límite inferior de la detección es de 40 mg/kg.
La muestra se somete a extracción mediante metanol diluido. El extracto se purifica sobre columna de óxido de aluminio y se trata mediante una solución metanólica de 2,7-dihidroxinaftaleno, hexaciano ferrato (III) de potasio, cianuro de potasio e hidróxido de sodio. Se desarrolla una coloración púrpura. El amprolio se determina por espectrofotometría a 530 nm.
51.2 Material y aparatos.
51.2.1 Erlenmeyer de 50, 250 y 500 ml de tapón de rosca.
51.2.2 Agitador.
51.2.3 Crisol filtrante, porosidad G 3, diámetro: 60 mm.
51.2.4 Columna de vidrio para cromatogafía (diámetro interior: 9 mm, longitud: 400 a 500 mm).
51.2.5 Centrífuga, con tubos de 25 ml de tapón de rosca.
51.2.6 Espectrofotómetro, con cubetas de 10 mm de espesor.
51.3 Reactivos.
51.3.1 Metanol p.a.
51.3.2 Metanol diluido.
Mezclar dos volúmenes de metanol (51.3.1) y un volumen de agua.
51.3.3 Solución al 0,2 por 100 (p/v) de hexacianoferrato (III) de potasio (K Fe(CN)) p.a.
Dicha solución se mantiene estable durante dos semanas.
51.3.4 Solución al 1 por 100 (p/v) de cianuro de potasio p.a. Dicha solución se mantiene estable durante dos semanas.
51.3.5 Solución al 1,125 por 100 (p/v) de hidróxido de sodio p.a.
51.3.6 Solución metanólica de hidróxido de sodio.
Tomar 15 ml de la solución (51.3.5) y completar a 200 ml mediante metanol (51.3.1).
51.3.7 Solución al 0,0025 por 100 (p/v) de 2,7-dihidroxinaftaleno. Disolver 25 mg de 2,7-dihidroxinaftaleno p.a. en metanol (51.3.1) y completar a 1.000 ml mediante metanol (51.3.1).
51.3.8 Reactivo de coloración. Introducir 90 ml de solución de 2,7-dihidroxinaftaleno (51.3.7) en un erlenmeyer de 250 ml (51.2.1), añadir 5 ml de solución de hexanocianoferrato (III) de potasio (51.3.3) y homogeneizar. Añadir a continuación 5 ml de solución de cianuro de potasio (51.3.4), tapar y homogeneizar. Dejar reposar durante treinta a treinta y cinco minutos, añadir 100 ml de solución metanólica de hidróxido de sodio (51.3.6), homogeneizar y filtrar sobre un crisol filtrante (51.2.3). Utilizar dicho reactivo en los setenta y cinco minutos que siguen a la filtración.
51.3.9 Oxido de aluminio para cromatografía de columna. Antes de la utilización, agitar durante treinta minutos, 100 g de óxido de aluminio con 500 ml de agua, filtrar, lavar tres veces el sedimento sobre el filtro con 50 ml de metanol (51.3.1) cada vez, secar por aspiración, dejar reposar una noche y secar durante dos horas a 100 ºC en una estufa de vacío. Dejar enfriar en desecador. Controlar la actividad analizando, a partir del punto (51.4.2), una cantidad determinada de solución patrón (51.3.11). El índice de recuperación del amprolio debe ser del 100 por 100 ± 4 por 100.
51.3.10 Sustancia patrón. Amprolio puro que responda a las características definidas a continuación:
- Punto de fusión (descomposición): 248 ºC.
- Coeficiente de extinción molecular a 265 y 235 nm en el agua destilada: 11,0 x 103.
51.3.11 Solución patrón. Pesar, con precisión de 0,1 mg, 50 mg de sustancia patrón (51.3.10). Disolver con metanol diluido (51.3.2) en un matraz aforado de 500 ml, completar a volumen por el mismo disolvente y homogeneizar. Tomar 10,0 ml completar a 50 ml mediante metanol diluido (51.3.2) en un matraz aforado y homogeneizar 1 ml de dicha solución contiene 20 microgramos de amprolio.
51.4 Procedimiento.
51.4.1 Extracción y purificación.
51.4.1.1 Piensos y premezclas. Pesar, con precisión de 1 mg, 10 g de muestra finamente dividida y homogeneizada. Para las premezclas, pesar de 3 a 6 g, con precisión de 1 mg. Introducir la muestra en un erlenmeyer de 250 ml (51.2.1) y añadir 100 ml exactamente de metanol diluido (51.3.2). Agitar durante sesenta minutos y filtrar. Diluir, si fuera necesario mediante metanol diluido (51.3.2) para obtener una solución que contenga de 5 a 15 microgramos de amprolio por ml. Introducir en una columna para cromatografía (51.2.4) previamente provista en su extremidad inferior de un tapón de algodón, 5 g de óxido de aluminio (51.3.9) y a continuación 25,0 ml del extracto. Dejar pasar el líquido, eliminar los 5 primeros ml y recoger los 12 ml siguientes en una probeta graduada.
51.4.1.2 Concentrados. Pesar, con precisión de 1 mg, 0,5 g de muestra finamente dividida y homogeneizada, introducirlos en un erlenmeyer de 500 ml (51.2.1), añadir 250 ml de metanol diluido (51.3.2), agitar durante sesenta minutos y filtrar. Tomar 5,0 ml del filtrado y completar a 200 ml mediante metanol diluido (51.3.2) en un matraz aforado.
51.4.2 Desarrollo de la coloración y medida del absorbancia. Tomar 5,0 ml de la solución obtenida en (51.4.1.1) o (51.4.1.2) e introducirlos en un tubo de centrífuga A (51.2.5). Introducir 5,0 ml de metanol diluido (51.3.2) en un tubo de centrífuga B (51.2.5). Añadir en cada tubo 10,0 ml del reactivo de coloración (51.3.8), tapar los tubos, homogeneizar y dejar reposar durante dieciocho minutos. Centrifugar a continuación durante tres minutos para obtener soluciones límpidas y decantar las soluciones A y B en los erlenmeyer de 50 ml (51.2.1).
Medir inmediatamente en el espectrofotómetro a 530 nm la absorbancia de la solución A, utilizando como blanco la solución B. Determinar la cantidad de amprolio refiriéndose a la curva de calibrado (51.4.3).
51.4.3 Curva de calibrado. Introducir en los tubos de centrífuga (51.2.5) volúmenes respectivos de 1,0-2,0-3,0-4,0 y 5,0 ml de solución patrón (51.3.11). Completar el volumen de los cuatro primeros tubos hasta 5,0 ml con metanol diluido (51.3.2). Añadir en los cinco tubos 10,0 ml de reactivo de coloración (51.3.8), tapar los tubos, homogeneizar y dejar reposar durante dieciocho minutos. Centrifugar a continuación durante tres minutos y decantar las soluciones en erlenmeyer de 50 ml (51.2.1).
Medir inmediatamente en el espectrofotómetro a 530 nm la absorbancia de las soluciones, utilizando como blanco una mezcla de 5 ml de metanol diluido (51.3.2) y 10 ml del reactivo de coloración (51.3.8). Trazar la curva de calibrado llevando a la ordenada los valores de las absorbancias y a la abscisa las cantidades correspondientes de amprolio en mg.
51.5 Cálculos.
51.5.1 Piensos y premezclas. El contenido en mg de amprolio por kg de muestra está dado por la fórmula:
A x F x 20.000
A x F x 20.000
P xFx 20.000
Siendo:
A = Cantidad, en mg, de amprolio determinada mediante la medición espectrofotométrica.
P = Peso, en g, de la muestra.
F = Coeficiente de dilución (efectuado si se diera el caso en 51.4.1.1.).
51.5.2 Concentrados. El contenido en amprolio en porcentaje de muestra está dado por la fórmula:
A x 200
A x 200
P x 200
Siendo:
A = Cantidad, en mg, de amprolio determinada por la medición espectrofotométrica.
P = Peso, en g, de la toma de muestras.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe exceder de:
- 10 mg/kg en valor absoluto, para los contenidos en amprolio inferiores a 100 mg/kg.
- 10 por 100, en valor relativo, para los contenidos comprendidos entre 100 y 5.000 mg/kg.
- 500 mg/kg, en valor absoluto, para los contenidos comprendidos entre 5.000 y 10.000 mg/kg.
- 5 por 100, en valor relativo, para los contenidos superiores a 10.000 mg/kg.
51.6 Referencias. Quinta Directiva de la Comisión de 25 de marzo de 1974. (74/203/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L, 108/7, de 22 de abril de 1974.
52 Etopabato
(Metil-4-acetamido-2-etoxibenzoato)
52.1 Principio. El método permite determinar el etopabato en los piensos, concentrados y premezclas. El límite inferior de detección es de 2 mg/kg.
La muestra se somete a extracción por metanol diluido. La solución se acidifica y se extrae con cloroformo. El extracto clorofórmico se lava primero con una solución alcalina y después con agua. El extracto purificado se concentra, el etopabato se hidroliza mediante el ácido clorhídrico diluido. El derivado aminado así formado se diazota y se copula con la N-(1-naftil) etilendiamina. El complejo coloreado se extrae mediante el butanol y la absorbancia de la solución se mide a 555 nm.
52.2 Material y aparatos.
52.2.1 Erlenmeyer de 250 ml, con tapón de rosca.
52.2.2 Embudos de decantación de 100 ml, con tapón esmerilado.
52.2.3 Agitador.
52.2.4 Evaporador rotativo a vacío con matraces de 250 ml.
52.2.5 Baño de agua.
52.2.6 Centrífuga, con tubos de 15 y 50 ml, de esmerilado normalizado.
52.2.7 Refrigerante de aire, con boca esmerilada.
52.2.8 Espectrofotómetro, con cubetas de 10 mm de espesor.
52.3 Reactivos.
52.3.1 Metanol p.a.
52.3.2 Metanol al 50 por 100 (v/v). Mezclar volúmenes iguales de metanol (52.3.1) y de agua.
52.3.3 Acido clorhídrico p.a. (d = 1,19).
52.3.4 Acido clorhídrico diluido a 1/10. Tomar 10,0 ml de ácido clorhídrico (52.3.3), completar a 100 ml con agua.
52.3.5 Acido clorhídrico 0,3N aproximadamente. Tomar 25,0 ml de ácido clorhídrico (52.3.3), completar a 1.000 ml con agua.
52.3.6 Cloroformo p.a.
52.3.7 Solución al 4 por 100 (p/v) de carbonato de sodio. Disolver 40 g de carbonato de sodio anhidro p.a. en agua y completar a 1.000 con agua.
52.3.8 Solución al 0,2 por 100 (p/v) de nitrito de sodio.
Disolver en agua 100 mg de nitrito de sodio p.a. y completar a 50 ml con agua en un matraz aforado. Preparar inmediatamente antes de su empleo.
52.3.9 Solución al 1,0 por 100 (p/v) de sulfamato de amonio. Disolver en agua 500 mg de sulfamato de amonio p.a. y completar a 50 ml con agua en un matraz aforado. Preparar inmediatamente antes de su empleo.
52.3.10 Solución al 0,2 por (p/v) de N-(1-naftil)etilendiamina. Disolver en agua 100 mg de N-(1-naftil)etilendiamina p.a. y completar a 50 ml con agua en un matraz aforado. Preparar inmediatamente antes de su empleo.
52.3.11 Cloruro de sodio anhidro, p.a.
52.3.12 N-butanol p.a.
52.3.13 Sustancia patrón. Etopabato puro.
52.3.14 Solución patrón.
52.3.14.1 Solución de 0,040 mg de etopabato por ml. Pesar con precisión de 0,1 mg, 40 g de sustancia patrón (52.3.13). Disolver con metanol diluido (52.3.2) en matraz aforado de 100 ml. Completar a volumen mediante el mismo disolvente y homogeneizar. Tomar 10,0 ml, completar a 100 ml con metanol (52.3.2) en un matraz aforado y homogeneizar. Dicha solución se mantiene estable durante un mes.
52.3.14.2 Solución de 0,016 mg de etopabato en 20 ml. Tomar 5,0 ml de la solución (52.3.14.1) completar a 250 ml con metanol diluido (52.3.2) en un matraz aforado y homogeneizar. Preparar antes de su empleo.
52.4 Procedimiento.
52.4.1 Extracción. Pesar, con precisión de 1 mg, una cantidad de muestra finamente dividida y homogeneizada que contenga 80 microgramos aproximadamente de etopabato. Introducir la muestra en un erlenmeyer de 250 ml (52.2.1) y añadir 100,0 ml de metanol diluido (52.3.2). Mezclar, cerrar el erlenmeyer y agitar durante una hora mediante el agitador (52.3.4). Dejar decantar, filtrar y eliminar los primeros ml del filtrado.
52.4.2 Purificación. Todas las operaciones descritas en este punto deben efectuarse rápidamente.
Introducir 20,0 ml del extracto límpido en un embudo de decantación de 100 ml (52.2.2), añadir 5,0 ml de ácido clorhídrico diluido al 1/10 (52.3.4) y 20,0 ml de cloroformo (52.3.6). Agitar primero con prudencia y después vigorosamente durante tres minutos. Dejar reposar hasta la separación de las fases y recoger la fase clorofórmica en un segundo embudo de decantación de 100 ml (52.2.2).
Extraer la fase ácida dos veces sucesivas mediante 30,0 ml de cloroformo (52.3.5) cada vez. Reunir los extractos clorofórmicos en el segundo embudo de decantación y eliminar la fase ácida. Añadir a la solución clorofórmica 10 ml de solución de carbonato de sodio (52.3.7), agitar durante tres minutos y dejar reposar hasta la separación de las fases. Recoger la fase clorofórmica en un tercer embudo de decantación de 100 ml (52.2.2) y eliminar la fase acuosa. Añadir a la solución clorofórmica 10 ml de solución de carbonato de sodio (52.3.7), agitar durante tres minutos y dejar reposar hasta la separación de las fases.
Recoger la fase clorofórmica en un cuarto embudo de decantación de 100 ml (52.2.2), lavar dos veces sucesivamente con 25 ml de agua cada vez, separar las fases acuosas y recoger cuantitativamente el extracto clorofórmico en un matraz de 250 ml (52.2.4). Reunir las fases acuosas, lavar los embudos de decantación vacíos mediante algunos ml de cloroformo (52.3.6) lavar a continuación la fase acuosa mediante dicho cloroformo. Separar la fase clorofórmica y añadirla al extracto recogido en un matraz.
52.4.3 Hidrólisis. Evaporar el extracto clorofórmico hasta 2 ml aproximadamente sobre un baño de agua a 50 ºC en el evaporador rotativo al vacío (52.2.4). Disolver el residuo con 2 ó 3 ml de metanol (52.3.1). Trasvasar cuantitativamente la solución a un tubo de centrífuga de 50 ml (52.2.6) con dos porciones de 10 ml y una porción de 5 ml de ácido clorhídrico 0,3N (52.3.5). Añadir algunos fragmentos de piedra pómez, homogeneizar y acoplar al tubo un refrigerante de aire (52.2.7). Sumergir el tubo en un baño de agua hirviendo y mantenerlo durante cuarenta y cinco minutos. Dejar enfriar a continuación bajo una corriente de agua fría.
52.4.4 Desarrollo de la coloración y medida de la absorbancia. Añadir 1,0 ml de solución de nitrito de sodio (52.3.8), agitar y dejar reposar dos minutos. Añadir 1,0 ml de solución de sulfamato de amonio (52.3.9), agitar y dejar reposar dos minutos. Añadir 1,0 ml de solución de N-(1-naftil) etilendiamina (52.3.10), agitar y dejar reposar diez minutos. Añadir 5,0 g de cloruro de sodio (52.3.11) y 10,0 ml de n-butanol (52.3.12), agitar vigorosamente hasta la disolución completa del cloruro de sodio.
Trasvasar la capa butanólica sobrenadante con ayuda de una pipeta, a un tubo de centrífuga de 15 ml (52.2.6) y centrifugar. Medir a continuación la absorbancia AA en espectofotómetro a 555 nm por comparación con el n-butanol (52.3.12).
52.4.5 Prueba en blanco. Efectuar una prueba en blanco aplicando el mismo método operatorio, a partir del punto 52.4.2 con 20,0 ml de metanol diluido (52.3.2). Medir la absorbancia AB a 555 nm por comparación con el n-butanol (52.3.12).
52.4.6 Prueba patrón. Efectuar una prueba aplicando el mismo método operatorio, a partir del punto 52.4.2, con 20,0 ml de solución patrón (52.3.14.2). Medir la absorbancia AC a 555 nm por comparación con el n-butanol (52.3.12).
52.5 Cálculos. El contenido en mg de etopabato por kg de muestra está dado por la fórmula:
A - A x 80
A - A x 80
A - A x P
Siendo:
A = Absorbancia de la solución procedente de la muestra.
A = Absorbancia de la solución resultante de la prueba en blanco.
A = Absorbancia de la solución resultante de la prueba patrón.
P = Peso en gramos de la muestra.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe exceder:
- Del 20 por 100, en valor relativo, para los contenidos en etopabato inferior a 7,5 mg/kg.
- Del 1,5 mg/kg, en valor absoluto, para los contenidos comprendidos entre 7,5 y 10 mg/kg.
- Del 15 por 100, en valor relativo, para los contenidos superiores a 10 mg/kg.
52.6 Referencias. Quinta Directiva de la Comisión de 25 de marzo de 1974. (74/203/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L, 108/7, de 22 de abril de 1974.
53. Dinitolmida (DOT 6 Zoalene)
(3,5-dinitro- o -toluamida)
53.1 Principio. El método permite determinar la dinitolmida (DOT) en los piensos, concentrados y premezclas. Los derivados del nitrofurano interfieren. El límite inferior de detección es de 40 mg/kg.
La muestra se somete a extracción con acetonitrilo. El extracto se purifica sobre óxido de aluminio y se filtra. Una parte alícuota del filtrado se evapora a sequedad. El residuo se recoge mediante dimetilformamida y se trata con etilendiamina. Se desarrolla una coloración púrpura. La dinitolmida se determina por espectrofotometría a 560 nm.
53.2 Material y aparatos.
53.2.1 Erlenmeyer de 250 ml, de esmerilado normalizado.
53.2.2 Refrigerante de reflujo, de esmerilado normalizado.
53.2.3 Crisol filtrante, porosidad G 3, diámetro 60 mm.
53.2.4 Aparato de filtración a vacío (por ejemplo aparato de Witt).
53.2.5 Baño de agua, regulado a 50 ºC.
53.2.6 Espectrofotómetro, con cubetas de 10 mm de espesor.
53.3 Reactivos.
53.3.1 Acetonitrilo al 85 por 100 (v/v). Mezclar 850 ml de acetonitrilo puro y 150 ml de agua, destilar la mezcla antes de su empleo; recoger la fracción que destila entre 75 y 77 ºC.
53.3.2 Oxido de aluminio para cromatografía en columna. Calcinar durante dos horas al menos a 750 ºC, enfriar en desecador y consevar en frasco de vidrio topacio de tapón esmerilado. Antes de su utilización, humedecer tal como se indica: introducir en un frasco de vidrio topacio 10 g de óxido de aluminio y 0,7 ml de agua, tapar herméticamente y calentar durante cinco minutos en un baño de agua hirviendo, agitando durante todo el tiempo con energía. Dejar enfriar agitándolo. Controlar la actividad sometiendo al análisis, a partir del punto (53.4.1), una cantidad determinada de solución patrón (53.3.6). La recuperación de la dinitolmida debe ser del 100 por 100 ± 2 por 100.
53.3.3 N,N-dimetilformamida al 95 por 100 (v/v): mezclar 95,0 ml de N,N-dimetilformamida p.a. y 5,0 ml de agua.
53.3.4 Etilendiamina p.a., contenido máximo en agua 2,0 por 100.
53.3.5 Sustancia patrón: 3,5 dinitro-o-toluamida pura que responda a las siguientes características:
Punto de fusión: 177 ºC.
Coeficiente de extinción molecular a 248 nm en acetonitrilo: 13,1 / 103.
Coeficiente de extinción molecular a 266 nm en N,N-dimetilformamida: 10,1 / 103.
53.3.6. Solución patrón. Pesar, con precisión de 0,1 mg, 40 mg de sustancia patrón (53.3.5). Disolver con acetonitrilo (53.3.1) en un matraz aforado de 200 ml. Completar a volumen con el mismo disolvente y homogeneizar. Tomar 20,0 ml, completar a 100 ml con acetonitrilo (53.3.1) en un matraz aforado y homogeneizar. 1 ml de dicha solución contiene 40 microgramos de dinitolmida.
53.4 Procedimiento.
53.4.1 Extracción y purificación. Pesar, con precisión de 1 mg, 10 g de muestra finamente dividida y homogeneizada. Para los concentrados y premezclas, pesar con precisión de 1 mg, 1 g. Introducir la muestra en un erlenmeyer de 250 ml (53.2.1) y añadir 65 ml de acetonitrilo (53.3.1). Mezclar, acoplar al erlenmeyer el refrigerante de reflujo (53.2.2) y calentar en el baño de agua (53.2.5) durante treinta minutos agitándolo continuamente. Dejar enfriar con corriente de agua fría. Añadir 20 g de óxido de aluminio (53.3.2), agitar durante tres minutos y dejar decantar.
Colocar un matraz aforado de 100 ml en el aparato de filtración (53.2.4), ajustar el crisol filtrante (53.2.3) y filtrar el líquido aspirando. Trasvasar a continuación el sedimento al crisol con unos ml de acetonitrilo (53.3.1) y aspirar. Cortar el vacío, volver a poner el sedimento en suspensión con unos ml de acetonitrilo (53.3.1) y aspirar de nuevo. Repetir estas últimas operaciones hasta que el volumen del filtrado alcance 95 ml aproximadamente. Completar el volumen a 100 ml mediante el acetonitrilo (53.3.1) y homogeneizar.
Si fuera necesario, tomar una parte alícuota y diluir mediante acetonitrilo (53.3.1) para obtener una solución que contenga de 5 a 15 microgramos de dinitolmida por ml.
53.4.2 Desarrollo de la coloración y medida de la absorbancia. Introducir respectivamente en tres vasos de 50 ml, A, B y C, 4,0 ml de la solución obtenida en (53.4.1). Añadir solamente al vaso C, 1,0 ml de solución patrón (53.3.6). Llevar los tres vasos sobre el baño de agua (53.2.5) situado bajo una campana de gases bien ventilada y evaporar a sequedad bajo corriente de aire. Dejar enfriar hasta la temperatura ambiente.
Añadir 10,0 ml de N,N-demetilformamida (53.3.3) al vaso A y 2,0 ml respectivamente a los vasos B y C. Dejar en contacto durante algunos minutos agitando ligeramente hasta la completa disolución del residuo. Añadir a continuación 8,0 ml de etilendiamina (53.3.4) en los vasos B y C y homogeneizar. Medir, cinco minutos exactamente después de la adición de etilendiamina, la absorbancia de las tres soluciones mediante el espectrofotómetro (53.2.6) a 560 nm, empleando como blanco la N,N-dimetilformamida (53.3.3).
53.5 Cálculos. El contenido en mg de dinitolmida por kg de muestra está dado por la fórmula:
A - A x F
A - A x F
A - B 3 P
Siendo:
A = Absorbancia de la solución A (testigo).
A = Absorbancia de la solución B (muestra).
A = Absorbancia de la solución C (patrón interno).
P = Peso en gramos de la muestra.
F = Coeficiente de dilución (efectuado si se diera el caso (53.4.1)).
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe exceder:
- De 10 mg/kg, en valor absoluto, para los contenidos en dinitolmida inferiores a 100 mg/kg.
- Del 10 por 100, en valor relativo, para los contenidos comprendidos entre 100 y 5.000 mg/kg.
- De 500 mg/kg, en valor absoluto, para los contenidos comprendidos entre 5.000 y 10.000 mg/kg.
- Del 5 por 100, en valor relativo, para los contenidos superiores a 10.000 mg/kg.
53.6 Referencias. Quinta Directiva de la Comisión de 25 de marzo de 1974 (74/203/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L, 108/7, de 22 de abril de 1974.
54. Nicarbazina
(Mezcla equimolecular de 4,4-dinitrocarbanilida
y 2-hidroxy-4,6-dimetil pirimidina)
54.1 Principio. El método permite determinar nicarbazina en los piensos, concentrados y premezclas que no contengan más de 5 por 100 de harinas forrejeras. Los derivados del nitrofurano, el acetilenheptina y el carbadox interfieren. El límite de detección es de 20 mg/kg.
La muestra se somete a extracción con N,N-dimetilformamida. El extracto se purifica en columna cromatográfica de óxido de aluminio: la nicarbazina se eluye con etanol. El eluato se trata con una solución etanólica de hidróxido de sodio: se desarrolla una coloración amarilla. La nicarbazina se determina espectrofotométricamente a 430 nm.
54.2 Material y aparatos.
54.2.1 Erlenmeyer de 250 ml con boca normalizada.
54.2.2 Refrigerante de reflujo, con boca normalizada.
54.2.3 Baño de agua hirviendo.
54.2.4 Centrífuga con tubos de 120 ml.
54.2.5 Columna cromatográfica de vidrio (diámetro interior: 25 mm, longitud 300 mm).
54.2.6 Espectrofotómetro con cubetas de 10 mm de espesor.
54.2.7 Buretas graduadas a 1/10 ml.
54.3 Reactivos.
54.3.1 N,N-dimetilformamida p.a.
54.3.2 Oxido de aluminio para cromatografía de columna. Calcinar durante dos horas al menos a 750 ºC, enfriar en desecador y conservar en frasco de vidrio topacio con tapón. Antes de utilizarlo, controlar su actividad sometiendo a análisis a partir del punto (54.4.2), una cantidad determinada de patrón (54.3.8.3). La recuperación de nicerbazina debe ser de 100 por 100 ± 2 por 100.
54.3.3 Alcohol etílico de 95 por 100 (v/v).
54.3.4 Alcohol etílico de 80 por 100 (v/v).
54.3.5 Solución al 50 por 100 (p/v) de hidróxido de sodio p.a.
54.3.6 Solución etanólica al 1 por 100 (p/v) de hidróxido de sodio. Tomar 1 ml de la solución (54.3.5) en un matraz aforado de 50 ml y enrasar con etanol del 80 por 100 (54.3.4). Preparar en el momento de empleo.
54.3.7 Sustancia patrón. Nicarbazina pura, coeficiente de extinción molecular a 362 nm en N,N-dimetilformamida es de 37,8 x 10 3.
54.3.8 Solución patrón.
54.3.8.1 Solución de 1,25 mg de nicarbazina por ml. Pesar con una precisión de 0,1 mg, 125 mg de sustancia patrón (54.3.7). Disolver en 75 ml de N,N-dimetilformamida (54.3.4), en un matraz aforado de 100 ml calentando ligeramente. Dejar enfriar, completar a volumen con el mismo solvente y homogeneizar. Conservar al abrigo de la luz.
54.3.8.2 Solución de 0,125 mg de nicarbazina por ml. Tomar 10 ml de la solución (54.3.8.1) y completar a 100 ml con N,N-dimetilformamida (54.3.1) en un matraz aforado y homogeneizar.
54.3.8.3 Solución de 0,025 mg de nicarbazina por ml. Tomar 20 ml de la solución (54.3.8.2), completar a 100 ml con N,N-dimetilformamida (54.3.1) en un matraz aforado y homogeneizar.
54.4 Procedimiento.
54.4.1. Extracción. Pesar, con precisión de 1 mg, 10 g de muestra finamente dividida y homogénea. Para concentrados y premezclas pesar 1 g con la precisión de 1 mg, introducir la muestra en un erlenmeyer de 250 ml (54.2.1) y añadir 100 ml exactamente de N,N-dimetilformamida (54.3.1). Mezclar, acoplar a un refrigerante de reflujo (54.2.2) y calentar en baño de agua (54.2.3) durante 15 minutos agitando de vez en cuando. Dejar enfriar bajo corriente de agua fría.
Trasvasar a continuación el líquido sobrenadante a un tubo de centrífuga (54.2.4) y centrifugar durante tres minutos aproximadamente.
Si fuera necesario pipetear 25 ml del sobrenadante y diluir con N,N-dimetilformamida (54.3.1) para obtener una solución que contenga de 2 a 10 microgramos de nicarbazina por ml.
54.4.2. Cromatografía. Introducir en una columna cromatográfica (54.2.5) 30 g de óxido de aluminio (54.3.2) en suspensión en N,N-dimetilformamida (54.3.1). Dejar descender el líquido hasta 1 cm por encima de la columna de óxido de aluminio e introducir en seguida en la columna, 25 ml del extracto obtenido en (53.4.1). Dejar pasar el líquido evitando dejar la columna seca y lavar tres veces la columna con 10 ml de N,N-dimetilformamida (54.3.1) cada vez. Eluir enseguida con 70 ml de etanol al 95 por 100 (54.3.3). Eliminar los 10 primeros ml del eluato y recoger el resto en fracciones como sigue:
- Una fracción a) de 5 ml.
- Una fracción b) de 50 ml en un matraz aforado.
- Una fracción c) de 5 ml.
Controlar que las fracciones a) y c) no presenten coloración amarilla por la adición de solución etanólica de hidróxido de sodio (54.3.6). Proseguir las operaciones sobre la fracción b) como se indica en (54.4.3).
54.4.3. Desarrollo de la coloración y medida de la absorbancia. Introducir respectivamente 20 ml de la fracción b) en dos matraces aforados A y B de 25 ml. Añadir al matraz A 5,0 ml de solución etanólica de hidróxido de sodio (54.3.6) y al matraz B 5,0 ml de etanol de 95 por 100 (54.3.3). Homogeneizar.
Medir en los primeros cinco minutos la absorbancia de las soluciones a 430 nm utilizando como blanco una mezcla de 20,0 ml de etanol del 95 por 100 (54.3.3) y 5 ml de solución etanólica de hidrñóxido de sodio (54.3.6).
La diferencia de las absorbancias ente la solución B y A se interpola en la curva de calibrado (54.4.4) para obtener la cantidad de nicarbazina.
54.4.4. Curva de calibrado. Tratar 25 ml de la solución patrón (54.3.8.3) por cromatografía como se indica en (54.4.2). Trasvasar a una bureta graduada (54.2.7) la fracción b) del eluato y pipetear en matraces secos de 25 ml respectivamente los siguientes volúmenes: 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 y 10,0 ml (correspondiendo a 0,025, 0,050, 0,075, 0,100 y 0,125 mg de nicarbazina). Añadir a cada matraz 5,0 ml de solución etanólica de hidróxido de sodio (54.3.6) enrasar con etanol de 95 por 100 (54.3.3) y homogeneizar.
Medir en los primeros cinco minutos la absorbancia de las soluciones a 430 nm, utilizando como blanco una mezcla de 20 ml de etanol del 95 por 100 (54.3.3) y 5,0 ml de solución etanólica de hidróxido de sodio. Trazar la curva patrón representando en ordenadas el valor de la absorbancia y en abscisas las cantidades correspondientes de nicarbazina en mg.
54.5 Cálculos. La cantidad de nicarbazina en mg por kg de muestra viene dada por la fórmula:
A x F x 10.000
A x F x 10.000
P x F x 10.000
Siendo:
A = Cantidad, en mg, de nicarbazina determinada por medida espectrofotométrica.
P = Peso, en g, de la muestra.
F = Coeficiente de dilución (efectuado eventualmente en 54.4.1).
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe sobrepasar los siguientes valores:
- 10 mg/kg, en valor absoluto, para contenidos en nicarbazina inferiores a 100 mg/kg.
- 10 por 100, en valor relativo, para contenidos comprendidos entre 100 y 5.000 mg/kg.
- 500 mg/kg, en valor absoluto, para contenidos comprendidos entre 5.000 y 10.000 mg/kg.
- 5 por 100, en valor relativo, para contenidos superiores a 10.000 mg/kg.
54.6 Referencias. Quinta Directiva de la Comisión de 25 de marzo de 1974 (74/203/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L, 108/7, de 22 de abril de 1974.
55. Buquinolato
(Carboxilato de etil-4-hidroxi-6,7
diiso-butoxi-3-quinoleína)
55.1 Principio. El método permite la determinación de buquinolato en los piensos, concentrados y premezclas. El límite inferior de detección es de 10 mg/kg. El decoquinato interfiere en la dosificación.
El buquinolato se extrae de la muestra con cloroformo. El extracto se evapora a sequedad, el residuo se recoge con cloroformo y la solución se cromatografía en capa fina. El buquinolato es eluido por etanol y determinado espectrofluorimétricamente por comparación con soluciones patrón.
55.2 Material y aparatos.
55.2.1 Erlenmeyer de 50 y 250 ml con tapón de rosca.
55.2.2 Agitador.
55.2.3 Centrífuga con tubos de 15 ml con tapón de rosca.
55.2.4 Baño de agua termorregulado a 50 ºC.
55.2.5 Equipo para cromatografía en capa fina.
55.2.6 Placas de vidrio para cromatografía en capa fina de 200 x 200 mm, preparadas como sigue: extender uniformemente sobre las placas una capa de 0,5 mm de espesor gel de sílice G (55.3.5) (55.6.1). Se dejan secar durante quince minutos al aire. Después se introducen durante dos horas a 110 ºC en la estufa (55.2.11). Se enfrían en desecador que contenga gel de sílice como deshidratante.
Se pueden emplear placas equivalentes ya preparadas.
55.2.7 Micropipetas de 0,50 ml.
55.2.8 Colector de zonas para cromatografía en capa fina.
55.2.9 Lámpara de ultravioleta de onda corta.
55.2.10 Espectrofluorímetro equipado con una lámpara de xenon y de dos monocromadores.
55.2.11 Estufa de aire forzado y temperatura regulable de 0 ºC a 150 ºC.
55.2.12 Aparato rotativo de evaporación al vacío con matraz de 250 ml.
55.3 Reactivos.
55.3.1 Cloroformo p.a.
55.3.2 Etanol 96 por 100 (v/v) p.a.
55.3.3 Mezcla cloroformo-etanol. Mezclar 10 volúmenes de cloroformo (55.3.1) y un volumen de etanol (55.3.2).
55.3.4 Etanol 80 por 100 (v/v) p.a.
55.3.5 Gel de sílice G para cromatografía en capa fina.
55.3.6 Buquinolato calidad patrón.
55.3.7 Soluciones patrón:
55.3.7.1 Soluciones patrón 0,1 mg/ml de buquinolato. Pesar 50 mg de sustancia patrón (55.3.6) con la precisión de 0,1 mg. Disolver en cloroformo (55.3.1) y en caliente, en un baño de agua a 50 ºC. Trasvasar cuantitativamente a un matraz aforado de 250 ml. Dejar enfriar a temperatura ambiente. Completar con cloroformo (55.3.1) hasta el aforo y homogeneizar.
55.3.7.2 Soluciones patrón de trabajo. Pipetear en matraces aforados de 25 ml; 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 y 25,0 ml de la solución patrón (55.3.7.1). Completar hasta el aforo con cloroformo (55.3.1) y homogeneizar. Preparar en el momento de su utilización. Estas soluciones contienen respectivamente 0,04, 0,08, 0,12, 0,16 y 0,20 mg/ml de buquinolato.
55.4 Procedimiento.
55.4.1 Preparación de la muestra. Moler la muestra de tal manera que pase a través de un tamiz de 1 mm (conforme a las recomendaciones ISO R 565).
55.4.2 Extracción. Pesar con precisión de 1 mg una cantidad muestra preparada según (55.4.1) que contenga aproximadamente 1,25 mg de buquinolato e introducirla cuantitativamente en un erlenmeyer de 250 ml (55.2.1). Añadir 100,0 ml de cloroformo (55.3.1). Mezclar, tapar y agitar durante una hora en el agitador (55.2.2). Dejar decantar, filtrar y despreciar los primeros ml del filtrado.
Introducir 80 ml del filtrado límpido en el matraz del rotavapor (55.2.12). Evaporar casi hasta sequedad sobre un baño de agua (55.2.4). Trasvasar cuantitativamente el residuo oleoso a un matraz de 10 ml con ayuda de cloroformo y a través de un embudo de vástago estrecho. Completar el volumen con cloroformo (55.3.1) y si la solución no es límpida, centrifugar durante tres minutos a 3.000 rpm en tubo cerrado.
55.4.3 Cromatografía en capa fina. Depositar puntualmente sobre una placa de cromatografía (55.2.6) con ayuda de una micropipeta (55.2.7) y a una distancia respectiva de 2 cm, volúmenes de 0,25 ml del extracto obtenido en (55.4.2) y de las cinco soluciones de patrón (55.3.7.2).
Eluir el cromatograma en la cámara de desarrollo utilizando cloroformo (55.3.1) como eluyente hasta que el frente del solvente llegue al borde superior de la placa. Secar con ayuda de una corriente de aire. Volver a colocar la placa en la cámara de desarrollo, utilizando como eluyente la mezcla de cloroformo/etanol (55.3.3) hasta que el frente del solvente haya avanzado unos 12 cm. Sacar la placa de la cámara. Dejar evaporar el solvente. Examinar la placa bajo la luz ultravioleta de onda corta (55.2.9) y delimitar las manchas de buquinolato (valor de Rf 0,4 a 0,6) con la ayuda de una aguja.
55.4.4 Elución. Recoger la sílice de cada zona delimitada con la ayuda de un colector de zonas (55.2.8) en un tubo de centrífuga (55.2.3). Añadir a cada tubo 10 ml de etanol (55.3.4), agitar durante veinte minutos y después centrifugar durante cinco minutos a 3.000 rpm. Decantar las soluciones límpidas en los erlenmeyer de 50 ml (55.2.1).
55.4.5 Medida de la fluorescencia. Ajustar a 100 la escala del espectrofluorímetro (55.2.10) con la ayuda del eluato (55.4.4) obtenida de la solución patrón más concentrada. Utilizar para la excitación la longitud de onda comprendida entre 300 y 289 nm que dé la fluorescencia más intensa y para la emisión la longitud de onda de 375.
Medir en estas condiciones la intensidad de fluorescencia de los otros eluatos (55.4.4). Determinar a partir de los valores encontrados la cantidad (C) de buquinolato en mg contenida en los 10 ml del aluato de la muestra.
55.5 Cálculo. El contenido en mg de buquinolato por kg de muestra está dado por la fórmula:
C x 50.000
C x 50.000
P x 50.000
Siendo:
C = Cantidad en mg de buquinolato determinado por la medida espectrofluorimétrica.
P = Peso, en gramos, de la muestra tomada para el análisis.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no deben de diferir de:
- 50 por 100 del resultado más elevado para los valores de buquinolato comprendidos entre 10 y 20 mg/kg.
- 10 mg/kg en valor absoluto para los valores comprendidos entre 20 y 100 mg/kg.
- 10 por 100 del resultado más elevado para los valores comprendidos entre 100 y 5.000 mg/kg.
- 500 mg/kg en valor absoluto para los valores comprendidos entre 5.000 y 10.000 mg/kg.
- 5 por 100 del resultado más elevado para los valores superiores a 10.000 mg/kg.
55.6 Observaciones.
55.6.1 La preparación de las placas es como sigue: Mezclar 60 g de gel de sílice G (55.3.5) con 120 ml de agua destilada, en un erlenmeyer de 250 ml con tapón, agitando vigorosamente durante treinta a cuarenta y cinco segundos. La suspensión una vez bien homogeneizada, se vuelca rápidamente en el aplicador y se extiende uniformemente sobre las placas, una capa de 0,5 mm de espesor. Se dejan secar durante quince minutos al aire; después se introducen en la estufa (55.2.11) durante dos horas a 110 ºC. Se enfrían en desecador que contenga gel de sílice como deshidratante.
55.7 Referencias. Sexta Directiva de la Comisión de 20 de diciembre de 1974 (75/84/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L, 32/26, de 5 de febrero de 1975.
56. Sulfaquinoxalina
(2 sulfanilamidoquinoxalina)
56.1 Principio. El método permite la determinación de sulfaquinoxalina en los piensos compuestos, concentrador y premezclas. El límite inferior de la determinación es de 20 mg/kg. Interfieren otras sulfonamidas y el ácido arsanílico.
La sulfaquinoxalina se extrae de la muestra con dimetilformamida y cloroformo. Se hidroliza en medio alcalino. Después de la neutralización el derivado aminado se diazota y copula con la N-(1-naftil) etilendiamina. La absorbancia de la solución se mide a 545 nm.
56.2 Material y aparatos.
56.2.1 Erlenmeyers de 250 ml con boca normalizada y tapón de vidrio.
56.2.2 Agitador.
56.2.3 Crisoles filtrantes de porosidad 3, diámetro 80 mm, con kitasatos.
56.2.4 Embudos de decantación de 250 ml.
56.2.5 Matraces aforados de 50, 100, 250 y 500 ml.
56.2.6 Tubos de ensayo de 150 mm x 25 mm.
56.2.7 Baño de agua hirviente.
56.2.8 Espectrofotómetro con cubetas de 20 mm de paso óptico.
56.3 Reactivos.
56.3.1 N, N-Dimetilformamida p.a.
56.3.2 Cloroformo p.a.
56.3.3 Etanol absoluto.
56.3.4 Solución alcalina. Disolver en agua destilada 10 g de hidróxido de sodio p.a. y 25 g de cloruro de sodio p.a. Completar hasta 500 ml con agua destilada y homogeneizar.
56.3.5. Acido clorhídrico concentrado p.a. (d = 1,18).
56.3.6 Solución 0,1 por 100 (p/v) de nitrato de sodio. Disolver en agua destilada 100 mg de nitrito de sodio p.a., completar con agua destilada hasta 100 ml y homogeneizar. Preparar inmediatamente antes de usar.
56.3.7 Solución 0,5 por 100 (p/v) de sulfamato amónico. Disolver en agua destilada 500 mg de sulfamato amónico p.a. completar hasta 100 ml con agua destilada y homogeneizar. Preparar inmediatamente antes de usar.
56.3.8 Solución 0,1 por 100 (p/v) de diclorhidrato de N-(1-naftil) etilendiamina. Disolver en ácido clorhídrico p.a. 0,1 por 100 (v/v) 100 mg de diclorhidrato de N-(1-naftil) etilendiamina p.a. completar hasta 100 ml con el mismo ácido y homogeneizar. Preparar inmediatamente antes de usar.
56.3.9 Sustancia patrón. Sulfaquinoxalina pura.
56.3.10 Solución patrón. Pesar con precisión de 0,1 mg, 250 mg de sustancia patrón (56.3.9). Disolver en unos 50 ml de una solución de hidróxido de sodio (25 ml de una solución de hidróxido de sodio 0,1 N º 25 ml de agua), completar hasta 500 ml con agua destilada. Tomar 5 ml de esta solución y diluir a 100 ml con agua destilada. 1 ml de esta solución contiene 25 microgramos de sulfaquinoxalina.
56.4 Procedimiento.
56.4.1 Preparación de la muestra. Moler la muestra de tal manera que pase en su totalidad a través de una malla de 1 mm (conforme a la recomendación ISO R. 565).
56.4.2 Extracción. Pesar con la exactitud de mg una cantidad de muestra que contenga entre 0,25 a 1,25 mg de sulfaquinoxalina. Introducir cuantitativamente en un erlenmeyer de 250 ml (56.2.1) y añadir 20 ml de N, N, dimetilformamida (56.3.1). Mezclar y calentar durante treinta minutos sobre baño de agua (56.2.7). Dejar enfriar bajo corriente de agua fría. Añadir 60 ml de cloroformo (56.3.2) tapar el erlenmeyer y agitar durante treinta minutos con ayuda del agitador. (56.2.2).
Filtrar el líquido sobre el crisol filtrante (56.2.3) colocado en kitasatos y aspirar ligeramente. Lavar el erlenmeyer con cuatro porciones de 5 ml de cloroformo (56.3.2) y trasvasar sucesivamente los líquidos al crisol. Trasvasar rápidamente a continuación el filtrado a un embudo de decantación (56.2.4), lavar el kitasato con la ayuda de aproximadamente 15 ml de cloroformo (56.3.2) y trasvasar el líquido al embudo de decantación.
56.4.3 Hidrólisis. Añadir al embudo de decantación 50 ml de solución alcalina (56.3.4) y 5 ml de etanol (56.3.3). Mezclar bien evitando la formación de emulsión, bien sea invirtiendo el embudo unas 20 veces o bien agitando horizontalmente. Dejar reposar hasta la separación de las dos fases (la separación se completa generalmente alrededor de los quince minutos).
Trasvasar la fase superior (fase acuosa) a un matraz aforado de 250 ml (56.2.5). Extraer de nuevo de la fase clorofórmica con tres porciones de la solución alcalina (56.3.4) y trasvasar el extracto acuoso después de cada extracción, al matraz aforado (56.2.5). Completar hasta el aforo con agua destilada y homogeneizar.
Introducir 25,0 ml de la solución en un matraz aforado de 50 ml (56.2.5), añadir 5,0 ml de ácido clorhídrico (56.3.5). Completar hasta el aforo con agua destilada y homogeneizar. Filtrar, si fuese necesario y eliminar los primeros 15 ml del filtrado. Introducir 10 ml de la solución, en dos tubos de ensayo (56.2.6) A y B, respectivamente.
56.4.4 Desarrollo de color y medida de la absorbancia. Añadir a cada tubo 2,0 ml de solución de nitrito de sodio (56.3.6) agitar y dejar reposar tres minutos. Añadir 2,0 ml de solución de sulfamato amónico (56.3.7), agitar y dejar reposar dos minutos. Añadir a continuación 1,0 ml de solución de diclorhidrato de N(1-naftil)etilendiamina (56.3.8) en el tubo A y 1,0 ml de agua destilada en el tubo B. Mezclar bien el contenido de cada tubo. Conectar los tubos a una trompa de agua con la ayuda de juntas de goma y aplicar un pequeño vacío para eliminar el nitrógeno disuelto.
Medir después de diez minutos la absorbancia Aa y Ab, de las soluciones en el espectrofotómetro (56.2.8) a 545 nm tomando el agua destilada como blanco. Determinar a partir del valor Aa-Ab la cantidad (C) de sulfaquinoxalina presente en la solución de la muestra refiriéndose a la curva patrón (56.4.5) hecha previamente.
56.4.5 Curva patrón. Introducir en los matraces aforados de 100 ml (56.2.5), volúmenes de 2,0; 4,0; 6,0; 8,0, y 10,0 ml de la solución patrón (56.3.10) correspondientes a 50, 100, 150, 200 y 250 microgramos de sulfaquinoxalina. Añadir 8 ml de ácido clorhídrico (56.3.5) en cada matraz completando el volumen con agua destilada y homogeneizando.
Tomar 10 ml de cada solución, que corresponden respectivamente a 5, 10, 15, 20, y 25 microgramos de sulfaquinoxalina, e introducirlos en tubos de ensayo (56.2.6). Desarrollar el color como se indica en 56.4.4, primer párrafo. Medir a continuación la absorbancia a 545 nm empleando agua destilada como blanco. Trazar la curva patrón poniendo en ordenadas el valor de la absorbancia y en abscisas la cantidad correspondiente de sulfaquinoxalina expresada en microgramos.
56.5 Cálculos. La cantidad en mg de sulfaquinoxalina por kg de muestra viene dada por la siguiente fórmula:
Sulfaquinoxalina mg/kg = C x 50
Sulfaquinoxalina mg/kg = C x 50
Sulfaquinoxalina mg/kg = P x 50
Siendo:
C = Cantidad de sulfaquinoxalina en microgramos determinada por medida espectrofotométrica.
P = Peso, en gramos, de la muestra tomada para el ensayo.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no deben ser mayores de:
- 10 mg/kg en valor absoluto para contenidos de sulfaquinoxalina comprendida entre 20 y 100 mg/kg.
- 10 por 100 del resultado más elevado para contenidos comprendidos entre 100 y 5.000 mg/kg.
- 500 mg/kg en valor absoluto para los contenidos comprendidos entre 5.000 y 10.000 mg/kg.
- 5 por 100 del resultado más elevado para los contenidos superiores a 10.000 mg/kg.
56.6 Referencias. Sexta Directiva de la Comisión, de 20 de diciembre de 1974 (75/84/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 32/26, de 5 de febrero de 1975.
57. Furazolidona
(n-(5-nitro-2-furfuriliden)-3-amino-2-oxazolidona)
57.1 Principio. El método permite la determinación de furazolidona en los piensos, concentrados y premezclas. El límite inferior de la determinación es de 10 mg/kg.
La furazolidona es extraída con acetona después de que la muestra ha sido previamente desengrasada con éter de petróleo. El extracto es purificado en una columna cromatográfica de óxido de aluminio y la furazolidona se eluye con la acetona. El eluato se evapora a sequedad, y el residuo se recoge en alcohol amílico. La furazolidona es extraída con una solución de urea y la absorbancia del extracto es medida a 375 nm.
57.2 Material y aparatos.
57.2.1 Matraces aforados de vidrio color topacio de 100 y 250 ml.
57.2.2 Embudos de decantación de vidrio color topacio de 100 ml
57.2.3 Aparato de extracción Soxhlet o Twisselman.
57.2.4 Cartuchos de extracción 25 x 80 ó 28 x 100 mm.
57.2.5 Columna de vidrio para cromatografía, de diámetro interior 10 mm y longitud 300 mm.
57.2.6 Baño de agua termorregulado hasta 150 ºC.
57.2.7 Espectrofotómetro con cubetas de 10 mm de espesor.
57.3 Reactivos.
57.3.1 Acetona p.a.
57.3.2 Oxido de aluminio neutro para cromatografía. Granulometría 100 a 240 mallas preparada como sigue. Mezclar 500 g de óxido de aluminio con 1000 ml de agua destilada caliente y decantar a continuación el líquido sobrenadante. Repetir dos veces esta operación y filtrar seguidamente a través de un filtro Büchner. Secar el óxido de aluminio a 105 ºC hasta peso constante.
57.3.3 Acetato de amilo p.a.
57.3.4 Alcohol amílico. Conviene mezcla de isómeros.
57.3.5 Eter de petróleo, p. eb 40-60 ºC.
57.3.6 Solución de urea. Mezclar 90 g urea p.a. con 100 ml de agua destilada, calentar ligeramente para facilitar la disolución.
57.3.7 Sustancia patrón. Furazolidona pura.
57.3.8 Soluciones patrón. Pesar con precisión de 0,1 mg unos 25 mg de sustancia patrón (57.3.7). Introducirla cuantitativamente en un matraz aforado de 250 ml (57.2.1) completar hasta el aforo con acetona (57.3.1) y homogeneizar (1 ml de esta solución contiene 100 microgramos de furazolidona).
57.4 Procedimiento. Todas las manipulaciones deben efectuarse evitando la luz directa:
57.4.1 Preparación de la muestra. Moler la muestra de tal manera que pase a través de un tamiz de mallas de 1 mm, conforme a la recomendación ISO R 565.
57.4.2 Extracción. Pesar con exactitud de 1 mg, de 5 a 20 g de muestra bien homogeneizada (conteniendo como máximo 1 mg de furazolidona) en un cartucho de extracción (57.2.4). Colocarlo en el aparato de extracción (57.2.3) y extraer con éter de petróleo (57.3.5). Para el aparato Soxhlet son necesarios de 13 a 17 ciclos de solvente; para otros aparatos la duración de la extracción no debe ser inferior a treinta minutos. Retirar a continuación el cartucho del aparato, eliminar el solvente residual secando el cartucho y su contenido con ayuda de una corriente de aire caliente.
Para la extracción, propiamente dicha, colocar de nuevo el cartucho en el aparato de extracción y extraer con la acetona (57.3.1). Para el aparato Soxhlet al menos son necesarios 25 ciclos de solvente; para otros aparatos, las condiciones necesarias para obtención de una extracción completa deberán ser determinadas previamente. Evaporar el extracto acetónico sobre el baño de agua (57.2.6) hasta un volumen de 5 a 10 ml y dejar enfriar hasta temperatura ambiente.
57.4.3 Cromatografía. Introducir un pequeño tapón de lana de vidrio en el extremo inferior de la columna cromatográfica (57.2.5) y apretar el tapón con la ayuda de una varilla, para obtener un espesor de 2 a 3 mm. Preparar una suspensión de óxido aluminio (57.3.2) en acetona (57.3.1). Introducir la suspensión en la columna cromatográfica (57.2.5) y dejar reposar. La columna así obtenida debe de tener una altura de 200 mm aproximadamente. Dejar descender la acetona (57.3.1) hasta la superficie superior de la columna.
Trasvasar el extracto obtenido en (57.4.2) sobre la columna, lavar el matraz varias veces con acetona (57.3.1) y trasvasar los líquidos sobre la columna. Colocar un matraz apropiado debajo de la columna y eluir la furazolidona con la acetona (57.3.1).
El volumen total de la acetona usada, incluido el usado para el lavado, no debe ser superior a 150 ml.
57.4.4 Extracción y medida de la absorbancia. Evaporar el eluido obtenido en 57.4.3 hasta sequedad en baño de agua (57.2.6) (ver 57.5.1). Disolver el residuo en 10 ml de alcohol amílico (57.3.4) y trasvasar la solución a un embudo de decantación (57.2.2). Lavar el matraz con porciones sucesivas de 10 ml de acetato de amilo (57.3.3) y 10 ml de la solución de urea (57.3.6). Trasvasar estas soluciones a un embudo de decantación (57.2.2) y agitar vigorosamente durante dos minutos. Dejar reposar durante tres a cuatro minutos y recoger la fase acuosa en un matraz aforado de 100 ml (57.2.1). Repetir el lavado y la extracción con la ayuda de cuatro porciones de 10 ml de solución de urea (57.3.6) y recoger cada vez la fase acuosa en el matraz aforado. Completar el contenido del matraz hasta 100 ml con la solución de urea (57.3.6) y homogeneizar. Medir la absorbancia de la solución en el espectrofotómetro (57.2.7) a 375 nm tomando como blanco la solución de urea (57.3.6). Determinar la cantidad de furazolidona refiriéndose a la curva patrón (57.4.5).
57.4.5 Curva patrón. Preparar cuatro columnas cromatográficas (57.2.5) según el modelo operatorio indicado (57.4.3 primer párrafo). Introducir en la columna volúmenes de 2,5, 5,0, 7,5, y 10 ml de solución patrón (57.3.8).
Eluir cada columna con 150 ml de acetona (57.3.1) y continuar el modo operatorio como se indica en 57.4.4. Trazar la curva patrón poniendo en ordenadas la absorbancia y en abscisas las cantidades correspondientes de furazolidona en microgramos.
57.5 Cálculos. El valor en miligramos de furazolidona por kg de muestra está dado por la siguiente fórmula:
C
--
P
Siendo:
C = Cantidad en microgramos de furazolidona determinada por la medida fotométrica.
P = Peso en gramos de la muestra tomada para el análisis.
La diferencia entre los resultados de dos determinaciones hechas en paralelo y efectuadas sobre la misma muestra no deben diferir de:
- 50 por 100 del resultado más elevado para los valores de furazolidona comprendidos entre 10 y 20 mg/kg.
- 10 mg/kg en valor absoluto para los valores comprendidos entre 20 y 100 mg/kg.
- 10 por 100 del resultado más elevado para los valores comprendidos entre 100 y 5.000 mg/kg.
- 500 mg/kg en valor absoluto para los valores comprendidos entre 5.000 y 10.000 mg/kg.
- 5 por 100 del resultado más elevado para los valores superiores a 10.000 mg/kg.
57.6 Observaciones.
57.6.1 Ocasionalmente se obtiene una pequeña cantidad de diacetona-alcohol, producida por condensación de la acetona sobre el óxido de aluminio, que no obstaculiza las extracciones posteriores.
57.7 Referencias. Sexta Directiva de la Comisión de 20 de diciembre de 1974 (75/84/CEE). «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» número L 32/26, de 5 de febrero de 1975.
58. Determinación de la halofuginona
Hidrobromuro de DL-trans-7-bromo-6-cloro-3(3-(3-hidroxi-2 -piperidil)acetonil)-quinazolin-4-(3H) -ona
58.1 Principio. Determinación de la halofuginona en los alimentos para animales. El límite de determinación es de 1 mg/kg.
Tras tratarla con agua caliente, la halofuginona se extrae como base libre con acetato de etilo, y posteriormente se pasa como clorhidrato a una solución ácida acuosa. El extracto se purifica mediante una cromatografía de intercambio iónico. El contenido de halofuginona se determina mediante cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (CLAR) empleando un detector ultravioleta.
58.2 Material y aparatos.
58.2.1 Baño ultrasónico.
58.2.2 Evaporador rotatorio.
58.2.3 Centrífuga.
58.2.4 Equipo CLAR con detector ultravioleta de longitud de onda variable o detector array de fotodiodos.
58.2.4.1 Columna de cromatografía líquida (300 mm x 4 mm) con relleno de C, de 10 lm, o columna equivalente.
58.2.5 Columna de vidrio (300 nm x 10 mm) equipada con un filtro de vidrio poroso y una llave.
58.2.6 Filtros de fibra de vidrio, de un diámetro de 150 mm.
58.2.7 Filtros de membrana, de 0,45 lm.
58.2.8 Filtros de membrana, de 0,22 lm.
58.3 Reactivos.
58.3.1 Acetonitrilo, grado CLAR.
58.3.2 Resina amberlita XAD-2.
58.3.3 Amonio acetato.
58.3.4 Acetato de etilo.
58.3.5 Acido acético glacial.
58.3.6 Halofuginona patrón normalizada, hidrobromuro de DL-trans-7-bromo-6-cloro-3-(3-(3-hidroxi-2-piperidil) acetonil)-quinazolín-4-(3H)-ona, E 7,64.
58.3.6.1 Solución patrón de reserva de halofuginona (100 lg/ml). Pesar 50 mg de halofuginona (58.3.6) con una precisión de 0,1 mg en un matraz aforado de 500 ml; disolver el producto en solución tampón de acetato de amonio (58.3.18), completar el recipiente hasta la marca con la solución tampón y mezclar. Esta solución, almacenada en la oscuridad y a 5 ºC, se mantiene estable durante tres semanas.
58.3.6.2 Soluciones de calibrado. Verter 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 y 6,0 ml de la solución normalizada de reserva (58.3.6.1) en una serie de matraces aforados de 100 ml. Rellenar hasta la marca con fase móvil (58.3.21) y mezclar los líquidos. Estas soluciones tienen concentraciones de halofuginona de 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 y 6,0 lg/ml respectivamente. Estas soluciones han de prepararse cada vez que se vayan a usar.
58.3.7 Acido clorhídrico (densidad a 20 ºC aprox. 1,16 g/ml)
58.3.8 Metanol.
58.3.9 Nitrato de plata.
58.3.10 Ascorbato sódico.
58.3.11 Carbonato sódico.
58.3.12 Cloruro sódico.
58.3.13 EDTA (ácido etilendiaminotetracético, sal disódica).
58.3.14 Agua, grado CLAR.
58.3.15 Solución carbonato sódico c = 10 g/100 ml.
58.3.16 Solución de carbonato sódico saturada de cloruro sódico, c = 5 g/100 ml. Disolver 50 g de carbonato sódico (58.3.11) en agua, disolver hasta completar un litro y añadir cloruro de sodio (58.3.12) hasta que la solución esté saturada.
58.3.17 Acido clorhídrico, aprox. 0,1 mol/l. Diluir 10 ml de ácido clorhídrico (58.3.7) en agua, hasta un litro.
58.3.18 Solución tampón de acetato amónico, aprox. 0,25 mol/l. Disolver 19,3 g de acetato amónico (58.3.3) y 30 ml de ácido acético (58.3.5) en agua (58.3.14), y diluir hasta un litro.
58.3.19 Preparación de resina amberlita XAD-2. Lavar la cantidad adecuada de resina (58.3.2) con agua hasta que se hayan eliminado todos los iones cloruro, lo cual se comprobará mediante la prueba con nitrato de plata (58.3.20) en la fase acuosa descartada. Posteriormente lavar la resina con 50 ml de metanol (58.3.8), descartar el metanol y conservar la resina bajo metanol nuevo.
58.3.20 Solución de nitrato de plata, aprox. 0,1 mol/l. Disolver 0,17 g de nitrato de plata (58.3.9) en 10 ml de agua.
58.3.21 Fase móvil CLAR. Mezclar 500 ml de acetonitrilo (58.3.1) con 300 ml de solución tampón de acetato amónico (58.3.18) y 1.200 ml de agua (58.3.14). Ajustar el pH a 4,3 empleando el ácido acético (58.3.5). Filtrar la mezcla por un filtro de 0,22 um (58.2.8) y desgasificar la solución (por ejemplo, mediante ultrasonidos durante diez minutos). Esta solución, almacenada en la oscuridad y en un recipiente cerrado, es estable durante un mes.
58.4 Procedimiento. Observación: La halofuginona como base libre es inestable en soluciones alcalinas y de acetato de etilo. No deberá permanecer en acetato de etilo durante más de treinta minutos.
58.4.1 General.
58.4.1.1 Debe analizarse un pienso en blanco para asegurarse de que no contiene halofuginona ni sustancias interferentes.
58.4.1.2 Se debe llevar a cabo un test de recuperación, analizando el pienso en blanco después de enriquecerlo por adición de una cantidad de halofuginona, similar a la presente en la muestra problema. Para enriquecer a un nivel de 3 mg/kg, añadir 300 ll de la solución estándar de reserva (58.3.6.1) a 10 g del pienso en blanco, mezclar y esperar diez minutos antes de proceder a la extracción (58.4.2).
Nota: Para los efectos de este método, el pienso en blanco debe ser de tipo similar al de la muestra problema y en su análisis no se debe detectar halofuginona.
58.4.2 Extracción. Pesar 10 g de la muestra preparada con una precisión de 0,01 g en un tubo de centrífuga de 200 ml, añadir 0,5 g de ascorbato sódico (58.3.10), 0,5 g de EDTA (58.3.13) y 20 ml de agua, y mezclar todo. Sumergir el tubo en un baño de agua a 80 ºC durante cinco minutos. Tras enfriarlo a temperatura ambiente, añadir 20 ml de solución de carbonato sódico (58.3.15) y mezclar. Añadir inmediatamente 100 ml de acetato de etilo (58.3.4) y agitar enérgicamente a mano durante quince segundos. Colocar el tubo en el baño de ultrasonidos (58.4.1) durante tres minutos y aflojar el tapón. Centrifugar durante dos minutos y decantar la fase de acetato de etilo en un embudo separador de 500 ml a través de un filtro de fibra de vidrio (58.2.6). Repetir la extracción de la muestra con una segunda porción de 100 ml de acetato de etilo. Lavar los extractos combinados durante un minuto con 50 ml de solución de carbonato sódico saturada de cloruro sódico (58.3.16) y descartar la capa acuosa.
Extraer la capa orgánica durante un minuto con 50 ml de ácido clorhídrico (58.3.17). Pasar la capa ácida inferior a un embudo separador de 250 ml. Extraer de nuevo la capa orgánica durante un minuto y medio con otros 50 ml de ácido clorhídrico y combinar con el primer extracto. Lavar los dos extractos ácidos combinados agitándolos durante aproximadamente diez segundos con 10 ml de acetato de etilo (58.3.4).
Transferir cuantitativamente la capa acuosa a un matraz de fondo redondo de 250 ml y descartar la fase orgánica. Evaporar todo el acetato de etilo que quede en la solución ácida empleando un rotavapor (58.4.2). La temperatura del baño de agua no deberá superar los 40 ºC. A un vacío de aproximadamente 25 mbar se elimina todo el acetato de etilo residual en cinco minutos a 38 ºC.
58.4.3 Limpieza.
58.4.3.1 Preparación de la columna de resina amberlita.
Preparar una columna XAD-2 por cada extracto de muestra. Verter 10 g de resina preparada (58.3.19) en una columna de vidrio (58.2.5) empleando metanol (58.3.8). Colocar un trozo pequeño de lana de vidrio en la parte superior del lecho de resina. Dejar eluir el metanol de la columna y lavar la resina con 100 ml de agua, cortando el flujo cuando el líquido alcance la parte superior del lecho de resina. Antes de emplearla, dejar la columna en reposo durante diez minutos para equilibrarla. Nunca deberá permitirse que la columna se seque.
58.4.3.2 Limpieza de la muestra. Transferir el extracto (58.4.2) cuantitativamente a la parte superior de la columna de resina preparada (58.4.3.1.) y eluir, descartando el eluido. La velocidad de elución no deberá exceder de 20 ml/minuto. Aclarar el matraz de fondo redondo con 20 ml de ácido clorhídrico (58.3.17) y emplear este líquido para lavar la columna de resina. Eliminar todo resto de solución ácida con un chorro de aire. Desechar las aguas de lavado. Añadir 100 ml de metanol (58.3.8) a la columna y eluir 5-10 ml, recogiendo el eluido en un matraz de fondo redondo de 250 ml. Dejar el metanol restante durante diez minutos para que se equilibre con la resina y continuar con la elución a un ritmo que no supere los 20 ml/minuto, recogiendo el eluato en el mismo matraz de fondo redondo. Evaporar el metanol en el rotavapor (58.2.2); la temperatura del baño de agua no deberá exceder de 40º C. Transferir cuantitativamente el residuo a un matraz aforado de 10 ml empleando la fase móvil (58.3.21). Rellenar hasta el enrase con fase móvil y mezclar. Filtrar una alícuota por un filtro de membrana (58.2.7). Reservar esta solución para la determinación por CLAR (58.4.4).
58.4.4 Determinación por CLAR.
58.4.4.1 Parámetros. Las condiciones siguientes se ofrecen como guía; pueden usarse otras condiciones siempre que den los mismos resultados.
Columna de cromatografía líquida (58.2.4.1).
Fase móvil CLAR (58.3.21).
Flujo: de 1,5 a 2 ml por minuto.
Longitud de onda de detección: 243 nm.
Volumen de inyección: de 40 a 100 ll.
Comprobar la estabilidad del sistema cromatográfico inyectando varias veces la solución de calibrado (58.3.6.2) con un contenido de 3,0 lg/ml, hasta que se hayan alcanzado alturas (áreas) de pico y tiempos de retención constantes.
58.4.4.2 Curva de calibrado. Inyectar varias veces cada solución de calibrado (58.3.6.2) y medir las alturas (areas) de pico para cada concentración. Trazar una curva de calibrado empleando las alturas o áreas medias de los picos de las soluciones de calibrado como ordenadas y las correspondientes concentraciones en lg/ml como abscisas.
58.4.4.3 Solución de muestra. Inyectar varias veces el extracto de muestra (58.4.3.2), empleando el mismo volumen que se utiliza para las soluciones de calibrado y determinar la altura (área) media de los picos de la halofuginona.
58.5 Cálculos. A partir de la altura (área) media de los picos de halofuginona de la solución de muestra, determinar la concentración de la solución de muestra en lg/ml haciendo referencia a la curva de calibrado (58.4.4.2)
El contenido de halofuginona w (en mg/kg) de la muestra se obtiene mediante la siguiente fórmula:
c x 10
w =
m
Siendo:
c: Concentración de halofuginona de la solución de muestra en lg/ml.
m: Masa de la muestra utilizada para el ensayo en gramos.
58.6 Validación de los resultados.
58.6.1 Identidad. La identidad del producto analizado se puede confirmar mediante una co-cromatografía, o utilizando un detector de red de diodos (diode array), mediante el cual se comparan los espectros del extracto de la muestra y de la solución de calibrado (58.3.6.2) con un contenido de 6,0 lg/ml.
58.6.1.1 Co-cromatografía. Reforzar un extracto de muestra añadiéndole una cantidad apropiada de solución de calibrado (58.3.6.2). La cantidad de halofuginona añadida deberá ser similar a la cantidad calculada de halofuginona hallada en el extracto de la muestra.
Sólo la altura (área) del pico de halofuginona deberá aumentar según la cantidad añadida, teniendo en cuenta la dilución del extracto. La anchura de pico, a la mitad de su altura, deberá ser igual a la anchura original en + 10 por 100.
58.6.1.2 Detección por red de diodos (diode array). Los resultados se evalúan con arreglo a los siguientes criterios:
a) La longitud de onda del máximo de absorción de los espectros de la muestra y del patrón, registrados en el ápice del pico cromatográfico, debe ser la misma, dentro de un margen determinado por la resolución del detector. En el caso del detector de red de diodos, el margen está situado generalmente en + 2 nm.
b) Entre 225 y 300 nm, los espectros de la muestra y del patrón registrados en el ápice del pico cromatográfico, no deberán ser diferentes para aquellas partes del espectro comprendidas entre el 10 y 100 por 100 de absorción relativa. Se cumple este criterio cuando están presentes los mismos máximos y en ningún punto la desviación observada entre los dos espectros excede del 15 por 100 de la absorción del producto analizado patrón;
c) Entre 225 y 300 nm, los espectros de la pendiente de subida, el ápice y la pendiente de bajada del pico del cromatograma del extracto de la muestra, no deben ser distintos unos de otros en lo que se refiere a las partes del espectro comprendidas en la gama del 10-100 por 100 de absorción relativa. Este criterio se cumple cuando están presentes los mismos máximos y en ningún punto la desviación observada entre los espectros excede del 15 por 100 de la absorción del espectro en el ápice del pico.
Si no cumple alguno de estos criterios, no se confirma la presencia del producto analizado.
58.6.2 Repetibilidad. La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas llevadas a cabo con la misma muestra, no deberá superar los 0,5 mg/kg para un contenido de halofuginona de hasta 3 mg/kg.
58.6.3 Recuperación. La recuperación de la muestra en blanco reforzada deberá ser al menos del 80 por 100.
58.7 Referencias. Directiva de la Comisión 93/70/CEE. «Diario Oficial de la Comunidades Europeas», L 234, de 28 de julio de 1993.
58.8 Resultados de un estudio colaborativo. Se organizó un estudio colaborativo* en el que se analizaron tres muestras en ocho laboratorios.
* The Analyst 1983, 108: 1252-1256.
Resultados
Muestra A (blanco) tras su recepción / Muestra B (harina): Tras su recepción / Tras dos meses / Muestra C (granulado): Tras su recepción / Tras dos meses
Media (1) / n.d. / 2,80 / 2,42 / 2,89 / 2,45
DR / - / 0,45 / 0,43 / 0,40 / 0,42
CV / - / 16 / 18 / 14 / 17
rec / / 86 / 74 / 88 / 75
(1) Unidades en mg/kg.
n.d.: no se detectó.
DR: desviación standard de la reproducibilidad.
CVR: coeficiente de variación (porcentaje).
rec: recuperación (porcentaje).
59. Determinación del benzocuato de metilo
7-benziloxi-6-butil-3-metoxicarbonil-4-quinolona
59.1 Principio. El benzocuato de metilo se extrae de la muestra con solución metanólica de ácido metanosulfónico. El extracto se purifica por partición con diclorometano y cromatografía de intercambio iónico y, a continuación, por nueva extracción con diclorometano. El contenido de benzocuato de metilo se determina mediante cromatografía líquida de alta resolución en fase inversa (CLAR) empleando un detector ultravioleta.
Este método está concebido para la determinación de benzocuato de metilo en los alimentos para animales. El límite inferior de determinación es 1 mg/kg.
59.2 Material y aparatos.
59.2.1 Agitador de laboratorio.
59.2.2 Evaporador rotatorio.
59.2.3 Columna de vidrio (250 mm x 15 mm) provista de una llave y de un depósito de 200 ml de capacidad, aproximadamente.
59.2.4 Equipo de CLAR con detector ultravioleta de longitud de onda variable o detector de red de diodos.
59.2.4.1 Columna para cromatografía líquida de 300 mm x 4 mm, con relleno de C de 10 lm, o equivalente.
59.2.5 Filtros de membrana de 0,22 lm.
59.2.6 Filtros de membrana de 0,45 lm.
59.3 Reactivos.
59.3.1 Diclorometano.
59.3.2 Metanol, calidad para CLAR.
59.3.3 Fase móvil de CLAR. Mezcla de metanol (59.3.2) y agua (calidad CLAR) 75 + 25 (V + V).
Filtrar a través de un filtro de 0,22 lm (59.2.5) y desgasificar la solución, (por ejemplo, mediante tratamiento con ultrasonidos durante diez minutos).
59.3.4 Solución de ácido metanosulfónico, c = 2 por 100. Diluir 20,0 ml de ácido metanosulfónico a 1.000 ml con metanol (59.3.2).
59.3.5 Solución de ácido clorhídrico, c = 10 por 100. Diluir 100 ml de ácido clorhídrico (q c.a. 1,18 g/ml) a 1.000 ml con agua.
59.3.6 Resina de intercambio catiónico Amberlita CG-120 (Na), 100-200 mallas. La resina debe tratarse antes de su utilización: preparar una lechada con 100 g de resina y 500 ml de solución de ácido clorhídrico (59.3.5) y llevar a ebullición en una placa caliente, agitando continuamente. Dejar enfriar y decantar el ácido. Filtrar en vacío a través de un papel de filtro. Enjuagar la resina dos veces con porciones de agua de 500 ml y, a continuación, con 250 ml de metanol (59.3.2). Enjuagar la resina con otra porción de 250 ml de metanol y secar haciendo pasar aire a través de la torta de filtro. Guardar la resina desecada en botella tapada.
59.3.7 Sustancia patrón: benzocuato de metilo puro (7-benziloxi-6-butil-3-metoxicarbonil-4-quinolona).
59.3.7.1 Solución patrón madre de benzocuato de metilo, 500 lg/ml. Pesar 50 mg de la sustancia patrón (59.3.7) con precisión de 0,1 mg, disolver en solución de ácido metanosulfónico (59.3.4) en un matraz aforado de 100 ml, enrasar y mezclar.
59.3.7.2 Solución patrón intermedia de benzocuato de metilo, 50 lg/ml. Pasar 5,0 ml de la solución patrón madre de benzocuato de metilo (59.3.7.1) a un matraz aforado de 50 ml, enrasar con metanol (59.3.2) y mezclar.
59.3.7.3 Soluciones de calibrado. Transferir 1,0, 2,0, 3,0, 4,0 y 5,0 ml de la solución patrón intermedia de benzoato de metilo (59.3.7.2) a una serie de matraces aforados de 25 ml. Enrasar con fase móvil (59.3.3) y mezclar. Estas soluciones tienen concentraciones de benzocuato de metilo de 2,0, 4,0, 6,0, 8,0 y 10,0 lg/ml, respectivamente. Estas soluciones han de prepararse cada vez que se vayan a usar.
59.4 Procedimiento.
59.4.1 General.
59.4.1.1 Debe analizarse un pienso en blanco para asegurarse de que no contiene benzocuato de metilo ni sustancias interferentes.
59.4.1.2 Se debe llevar a cabo un ensayo de recuperación, analizando el pienso en blanco después de enriquecerlo por adición de una cantidad de benzocuato de metilo similar a la presente en la muestra. Para enriquecer a un nivel de 15 mg/kg, añadir 600 ll de la solución patrón madre (59.3.7.1) a 20 g del pienso en blanco, mezclar y esperar diez minutos antes de proceder a la extracción 59.4.2.
Nota: A los efectos de este método, el pienso en blanco debe ser de un tipo similar al de la muestra y en su análisis no se debe detectar benzocuato de metilo.
59.4.2 Extracción. Pesar con precisión de 0,01 g aproximadamente 20 g de la muestra preparada y trasferir a un matraz erlenmeyer de 250 ml. Añadir 100,0 ml de la solución de ácido metanosulfónico (59.3.4) y agitar mecánicamente (59.2.1) durante treinta minutos. Filtrar la solución a través de papel de filtro y conservar el filtrado para la fase de partición líquido-líquido (59.4.3).
59.4.3 Partición líquido-líquido. Transferir 25,0 ml del filtrado obtenido en el punto 59.4.2 a una ampolla de decantación de 500 ml que contenga 100 ml de solución de ácido clorhídrico (59.3.5). Añadir 100 ml de diclorometano (59.3.1) a la ampolla y agitar durante un minuto. Esperar a que se produzca la separación de las capas y verter la capa inferior (diclorometano) en un matraz redondo de 500 ml. Repetir la extracción de la fase acuosa con otras dos porciones de 40 ml de diclorometano y combinarlas con el primer extracto contenido en el matraz redondo. Evaporar el extracto de diclorometano hasta sequedad en el evaporador rotatorio (59.2.2) a 40 ºC a presión reducida. Disolver el residuo en 20-25 ml de metanol (59.3.2), tapar el matraz y guardar todo el extracto para la cromatografía de intercambio iónico (59.4.4).
59.4.4 Cromatografía de intercambio iónico.
59.4.4.1 Preparación de la columna de intercambio catiónico. Taponar con lana de vidrio el extremo inferior de la columna de vidrio (59.2.3). Preparar una lechada con 5,0 g de la resina de intercambio catiónico tratada (59.3.6) y 50 ml de ácido clorhídrico (59.3.5), verter en la columna de vidrio y dejar reposar. Eliminar el ácido sobrante, hasta que su nivel se sitúe apenas por encima de la superficie de resina y lavar la columna con agua hasta que el eluido dé neutro al tornasol. Transferir 50 ml de metanol (59.3.2) a la columna y dejar eluir hasta la superficie de la resina.
59.4.4.2 Cromatografía de columna. Mediante una pipeta, transferir cuidadosamente el extracto obtenido en el punto 59.4.3 a la columna. Enjuagar el matraz redondo con dos porciones de 5 a 10 ml de metanol (59.3.2) y transferir estos líquidos de lavado a la columna. Dejar pasar el extracto hasta la superficie de resina y lavar la columna con 50 ml de metanol, asegurándose de que el flujo no sea superior a 5 ml por minuto. Descartar el eluido. Eluir el benzocuato de metilo de la columna utilizando 150 ml de solución de ácido metanosulfónico (59.3.4) y recoger el eluido de la columna en un matraz erlenmeyer de 250 ml.
59.4.5 Partición líquido-líquido. Transferir el eluido obtenido en el punto 59.4.4.2 a una ampolla de decantación de un litro. Enjuagar el matraz erlenmeyer con 5 a 10 ml de metanol (59.3.2) y mezclar los líquidos de lavado con el contenido de la ampolla de decantación. Añadir 300 ml de una solución de ácido clorhídrico (59.3.5) y 130 ml de diclorometano (59.3.1). Agitar durante un minuto y dejar que las fases se separen. Transferir la capa inferior (diclorometano) a un matraz redondo de 500 ml. Repetir la extracción de la fase acuosa con dos nuevas porciones de 70 ml de diclorometano y mezclar en el matraz redondo estos dos extractos con el primero. Evaporar hasta sequedad el extracto de diclorometano en el evaporador rotatorio (59.2.2) a 40 ºC y presión reducida. Disolver los residuos en el matraz con unos 5 ml de metanol (59.3.2) y transferir cuantitativamente esta solución a un matraz aforado de 10 ml. Enjuagar el matraz redondo con dos nuevas porciones de 1 a 2 ml de metanol hasta el enrase y mezclar. Filtrar una porción alícuota por un filtro de membrana (59.2.6). Reservar esta solución para la determinación por CLAR (59.4.6).
59.4.6 Determinación por CLAR.
59.4.6.1 Parámetros. Las condiciones siguientes se ofrecen como guía: pueden usarse otras condiciones siempre que arrojen los mismos resultados.
Columna de cromatografía líquida: (59.2.4.1).
Fase móvil CLAR: mezcla de metanol y agua (59.3.3).
Flujo: de 1 a 1,5 ml/minuto.
Longitud de onda de detección: 265 nm.
Volumen de inyección: 20 a 25 ll.
Comprobar la estabilidad del sistema cromatográfico inyectando varias veces la solución de calibrado (59.3.7.3) con un contenido de 4 lg/ml, hasta que se hayan alcanzado alturas (o áreas) de pico y tiempos de retención constantes.
59.4.6.2 Curva de calibrado. Inyectar varias veces cada solución de calibrado (59.3.7.3) y medir las alturas de los picos (áreas) para cada concentración. Trazar una curva de calibrado empleando las medias de las alturas o áreas de los picos de las soluciones de calibrado como ordenadas y las concentraciones correspondientes en lg/ml como abscisas.
59.4.6.3 Solución de muestra. Inyectar varias veces el extracto de muestra (59.4.5), empleando el mismo volumen utilizado para las soluciones de calibrado. Determinar la altura (área) media de los picos de benzocuato de metilo.
59.5 Cálculos. A partir de la altura (área) media de los picos de benzocuato de metilo de la solución de muestra, determinar la concentración de la solución de muestra en lg/ml haciendo referencia a la curva de calibrado (59.4.6.2)
El contenido de benzocuato de metilo w (mg/kg) se obtiene mediante la siguiente fórmula:
w = / c x 40
m
Siendo:
c = Concentración de benzocuato de metilo de la solución de muestra en lg/ml.
m = Masa de la muestra utilizada para el ensayo, en gramos.
59.6 Comprobación de los resultados.
59.6.1 Identidad. La identidad del analito se puede confirmar mediante una co-cromatografía o utilizando un detector de red de diodos (diode array), con el que se comparan los espectros del extracto de la muestra y de la solución de calibrado (59.3.7.3) con un contenido de 10 lg/ml.
59.6.1.1 Co-cromatografía. Reforzar un extracto de muestra añadiéndole una cantidad apropiada de la solución patrón intermedia (59.3.7.2). La cantidad de benzocuato de metilo añadida deberá ser similar a la cantidad calculada de benzocuato de metilo hallado en el extracto de la muestra. Sólo la altura del pico de benzocuato de metilo deberá aumentar teniendo en cuenta tanto la cantidad añadida como la dilución del extracto. La anchura del pico, la mitad de su altura máxima, no deberá variar en ± 10 por 100 respecto de la anchura original.
59.6.1.2 Detección por red de diodos. Los resultados se evalúan con arreglo a los siguientes criterios:
a) La longitud de onda del máximo de absorción de los espectros de la muestra y del patrón, registrados en el ápice del pico cromatográfico, debe ser la misma, dentro de un margen determinado por la resolución del detector. En el caso del detector de red de diodos, el margen está situado generalmente en ± 2 nm.
b) Entre 220 y 350 nm, los espectros de la muestra y del patrón, registrados en el ápice del pico cromatográfico, no deberán ser diferentes para aquellas partes del espectro comprendidas entre 10 y 100 por 100 de absorción relativa. Se cumple este criterio cuando están presentes los mismos máximos, y en ningún punto observado la desviación entre dos espectros excede del 15 por 100 de la absorción del analito patrón.
c) Entre 220 y 350 nm, los espectros de la pendiente de subida, el ápice y la pendiente de bajada del pico cromatográfico del extracto de la muestra, no deben ser distintos unos de otros en lo que se refiere a las partes del espectro comprendidas en la gama del 10-100 por 100 de absorción relativa. Este criterio se cumple cuando están presentes los mismos máximos y en ningún punto observado la desviación entre los espectros excede del 15 por 100 de la absorción del espectro en el ápice del pico.
Si no se cumple alguno de estos criterios, no se confirma la presencia del analito.
59.6.2 Repetibilidad. La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas llevadas a cabo con la misma muestra no deberá superar el 10 por 100 relativo al resultado más elevado para un contenido de benzocuato de metilo comprendido entre 4 y 20 mg/kg.
59.6.3 Recuperación. La recuperación de la muestra en blanco reforzada deberá ser al menos del 90 por 100.
59.7 Resultados de un ensayo colaborativo. Se analizaron cinco muestras en diez laboratorios. Los análisis se efectuaron por duplicado para cada muestra.
Resultados
Muestra en blanco / Harina 1 / Gránulos / Harina 2 / Gránulos
(mg/kg) / n.d. / 4,50 / 4,50 / 8.90 / 8,70
S mg/kg / - / 0,30 / 0,20 / 0,60 / 0,50
CV (porcentaje) / - / 6,70 / 4,40 / 6,70 / 5,70
S (mg/kg) / - / 0,40 / 0,50 / 0,90 / 1,00
CV (porcentaje) / - / 8,90 / 11,10 / 10,10 / 11,50
Recuperación (porcentaje) / - / 92,00 / 93,00 / 92,00 / 89,00
S = Desviación estándar de la repetibilidad.
CV = Coeficiente de variación de la repetibilidad.
S = Desviación estándar de la reproducibilidad.
CV = Coeficiente de variación de la reproducibilidad.
59.8 Referencias. Directiva 93/117/CEE. «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» L 329, de 30 de diciembre de 1993.
60. Determinación de la robenidina
Clorhidrato de 1,3-bis ((4-clorobenciliden) amino)
guanidina
60.1 Principio. La muestra se extrae con metanol acidificado. Se deseca el extracto y se purifica en una columna de óxido de aluminio una parte alícuota. La robenidina se eluye de la columna con metanol, se concentra y se completa hasta un volumen adecuado con fase móvil. El contenido de robenidina se determina mediante cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (CLAR) empleando un detector ultravioleta.
Este método está concebido para la determinación de la robenidina en los alimentos para animales. El límite mínimo de determinación es de 5 mg/kg.
60.2 Material y aparatos.
60.2.1 Columna de vidrio. Columna de vidrio ámbar provista de llave y de un depósito de 150 ml de capacidad aproximadamente, con un diámetro interior de 10,15 mm y una longitud de 250 mm.
60.2.2 Agitador oscilante de laboratorio.
60.2.3 Evaporador rotatorio.
60.2.4 Equipo de CLAR con detector ultravioleta de longitud de onda variable o detector de red de diodos que funcione en el intervalo 250-400 nm.
60.2.4.1 Columna para cromatografía de líquidos: 300 mm x 4 mm con relleno de 10 lm de C o equivalente.
60.2.5 Papel de filtro de fibra de vidrio (Whatman GF/A o equivalente).
60.2.6 Filtros de membrana de 0,22 lm.
60.2.7 Filtros de membrana de 0,45 lm.
60.3 Reactivos.
60.3.1 Metanol.
60.3.2 Metanol acidificado. Transferir 4,0 ml de ácido clorhídrico (P ca, 1,18 g/ml) a un matraz graduado de 500 ml, enrasar con metanol (58.3.1.) y mezclar. Esta solución debe prepararse antes de cada uso.
60.3.3 Acetonitrilo de calidad para CLAR.
60.3.4 Tamiz molecular. Tipo 3A, perlas de 8-12 mallas (perlas de 1,6-2,5 mm, aluminosilicato cristalino, 0,3 mm de diámetro de poro).
60.3.5 Oxido de aluminio: ácido, grado de actividad I para cromatografía de columna. Transferir 100 g de óxido de aluminio a un recipiente apropiado y añadir 2,0 ml de agua. Tapar y agitar durante veinte minutos aproximadamente. Almacenar en un recipiente bien cerrado.
60.3.6 Solución de potasio dihidrógeno fosfato, c = = 0,025 mol/l. En un matraz aforado de 1.000 ml disolver 3,40 g de potasio dihidrógeno fosfato en agua (de calidad para CLAR), enrasar y mezclar.
60.3.7 Solución de disodiohidrógeno fosfato, c = = 0,025 mol/l. En un matraz aforado de 1.000 ml disolver 3,55 g de fosfato monoácido de sodio anhidro (o 4,45 g. de dihidrato u 8,95 g de dodecahidrato), enrasar y mezclar.
60.3.8 Fase móvil de la CLAR. Mezclar los reactivos siguientes:
650 ml de acetonitrilo (60.3.3).
250 ml de agua (de calidad para CLAR).
50 ml de solución de potasio dihidrógeno fosfato (60.3.6).
50 ml de solución de disodiohidrógeno fosfato (60.3.7).
Filtrar por un filtro de 0,22 lm (60.2.6) y desgasificar la solución (por ejemplo, mediante la aplicación de ultrasonidos durante diez minutos).
60.3.9 Sustancia patrón. Robenidina pura: Clorhidrato de 1,3-bis ((4-clorobenciliden) amino) guanidina (E 758).
60.3.9.1 Solución patrón madre de robenidina: 300 lg/ml. Pesar 30 mg de sustancia patrón de robenidina (60.3.9) con precisión de 0,1 mg. En un matraz aforado de 100 ml disolver en metanol acidificado (60.3.2), enrasar con el mismo disolvente y mezclar. Envolver el matraz con papel de aluminio y guardar al abrigo de la luz.
60.3.9.2 Solución patrón de robenidina: 12 lg/ml. Transferir 10,0 ml de la solución patrón madre (60.3.9.1) a un matraz aforado de 250 ml, enrasar con la fase móvil (60.3.8) y mezclar. Envolver el matraz con papel de aluminio y guardar al abrigo de la luz.
60.3.9.3 Solución de calibrado. Transferir 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 y 25,0 ml de la disolución patrón intermedia (60.3.9.2) a una serie de matraces aforados de 50 ml. Enrasar con fase móvil (60.3.8) y mezclar. Estas soluciones corresponden, respectivamente, a 1,2; 2,4; 3,6; 4,8 y 6,0 lg/ml de robenidina. Estas soluciones deben prepararse antes de cada uso.
60.4 Procedimiento.
Nota: La robenidina es sensible a la luz. Deberá utilizarse material de vidrio ámbar en todas las operaciones.
60.4.1 General.
60.4.1.1 Deberá analizarse un pienso en blanco para comprobar que no contiene ni robenidina ni sustancias interferentes.
60.4.1.2 Deberá efectuarse un ensayo de recuperación, que consistirá en analizar el pienso en blanco enriquecido con la adición de una cantidad de robenidina similar a la que contenga la muestra. Para enriquecer a un nivel de 60 mg/kg, transferir 3,0 ml de la solución patrón madre (60.3.9.1) a un matraz erlenmeyer de 250 ml. Evaporar la solución en una corriente de nitrógeno hasta que resten 0,5 ml aproximadamente. Añadir 15 g de pienso en blanco, mezclar y esperar diez minutos antes de efectuar la extracción (60.4.2).
Nota: A efectos del presente método, el pienso en blanco debe ser de tipo similar al de la muestra y no debe detectarse robenidina en su análisis.
60.4.2 Extracción. Pesar, con precisión de 0,01 g, 15 g aproximadamente de la muestra preparada. Transferir a un matraz erlenmeyer de 250 ml y añadir 100,0 ml de metanol acidificado (60.3.2), tapar y agitar durante una hora en el agitador (60.2.2). Filtrar la solución por un papel de filtro de fibra de vidrio (60.2.5) y recoger todo el filtrado en un matraz erlenmeyer de 150 ml. Añadir 7,5 g de tamiz molecular, tapar y agitar durante cinco minutos. Filtrar inmediatamente por un papel de filtro de fibra de vidrio. Conservar esta solución para la fase de purificación (60.4.3).
60.4.3 Purificación.
60.4.3.1 Preparación de la columna de óxido de aluminio. Introducir un pequeño tapón de fibra de vidrio en el extremo inferior de la columna de vidrio. Pesar 11,0 g de óxido de aluminio preparado (60.3.5) y transferir a la columna. Durante esta fase, deberá procurarse reducir al máximo la exposición a la atmósfera. Golpear suavemente el extremo inferior de la columna cargada a fin de que se sedimente el óxido de aluminio.
60.4.3.2 Purificación de la muestra. Transferir con una pipeta a la columna 5,0 ml del extracto de muestra preparado en el punto 60.4.2. Colocar la punta de la pipeta cerca de la pared de la columna y dejar que la solución quede absorbida en el óxido de aluminio. Eluir la robenidina de la columna con 100 ml de metanol (60.3.1), manteniendo un flujo de 2-3 ml/minuto, y recoger el eluido en un matraz redondo de 250 ml. Evaporar hasta sequedad la solución de metanol a presión reducida y a una temperatura de 40 ºC, utilizando un evaporador rotatorio (60.2.3). Disolver nuevamente el residuo en 3-4 ml. de fase móvil (60.3.8) y transferir cuantitativamente a un matraz aforado de 10 ml. Lavar el matraz con varias porciones de 1-2 ml de fase móvil y transferir los lavados al matraz aforado. Enrasar con el mismo disolvente y mezclar. Filtrar una alícuota por un filtro de 0,45 lm (60.2.7). Conservar esta solución para la determinación mediante CLAR (60.4.4).
60.4.4 Determinación mediante CLAR.
60.4.4.1 Parámetros. Las condiciones siguientes se ofrecen como guía; pueden usarse otras condiciones siempre que den los mismos resultados.
Columna para cromatografía de líquidos (60.2.4.1).
Fase móvil CLAR (60.3.8).
Flujo: de 1,5 a 2 ml por minuto.
Longitud de onda del detector: 317 nm.
Volumen de inyección: de 20 a 50 ll.
Comprobar la estabilidad del sistema cromatográfico inyectando varias veces la solución de calibrado (60.3.9.3) con un contenido de 3,6 lg/ml, hasta que se hayan alcanzado alturas o áreas de pico y tiempos de retención constantes.
60.4.4.2 Curva de calibrado. Inyectar varias veces cada solución de calibrado (60.3.9.3) y medir las alturas (áreas) de pico para cada concentración. Trazar una curva de calibrado empleando las alturas o áreas medias de los picos de las soluciones de calibrado como ordenadas y las correspondientes concentraciones en lg/ml como abscisas.
60.4.4.3 Solución de muestra. Inyectar varias veces el extracto de muestra (60.4.3.2), empleando el mismo volumen utilizado para las soluciones de calibrado y determinar la altura (o área) media de los picos de robenidina.
60.5 Cálculos. A partir de la altura (área) media de los picos de robenidina de la solución de muestra, determinar la concentración de la solución de muestra en lg/ml haciendo referencia a la curva de calibrado (60.4.4.2).
El contenido de robenidina w (en mg/kg) de la muestra se obtiene mediante la siguiente formula:
w = (c x 200): m Siendo:
c = Concentración de robenidina de la solución de muestra lg/ml.
m = Masa, en gramos, de la muestra utilizada para el ensayo.
60.6 Comprobación de los resultados.
60.6.1 Identidad. La identidad del analito se puede confirmar mediante una co-cromatografía, o utilizando un detector de red de diodos, mediante el cual se comparan los espectros del extracto de la muestra y de la solución de calibrado (60.3.9.3) con un contenido de 6,0 lg/ml.
60.6.1.1 Co-cromatografía. Reforzar un extracto de muestra añadiéndole una cantidad apropiada de solución de calibrado (60.3.9.3). La cantidad de robenidina añadida deberá ser similar a la cantidad calculada de robenidina hallada en el extracto de la muestra.
Sólo deberá aumentar la altura del pico de robenidina, teniendo en cuenta tanto la cantidad añadida como la dilución del extracto. La anchura del pico, a la mitad de su altura máxima, deberá estar comprendida dentro del ± 10 por 100 de la anchura original.
60.6.1.2 Detección por red de diodos. Los resultados se evalúan con arreglo a los siguientes criterios:
a) La longitud de onda a la que se da la absorción máxima de los espectros de la muestra y del patrón, registrados en el ápice del pico cromatográfico, debe ser la misma dentro de un margen determinado por la resolución del detector. En el caso del detector de red de diodos, el margen está situado generalmente en ± 2 nm.
b) Entre 250 y 400 nm, los espectros de la muestra y del patrón registrados en el ápice del pico cromatográfico no deberán ser diferentes para aquellas partes del espectro comprendidas entre el 10 y el 100 por 100 de la absorbancia relativa. Este criterio se cumple cuando están presentes los mismos máximos y en ningún punto observado la desviación entre los dos espectros excede del 15 por 100 de la absorbancia del analito patrón.
c) Entre 250 y 400 nm los espectros de la pendiente de subida, el ápice y la pendiente de bajada del pico del cromatograma del extracto de la muestra no deben ser distintos unos de otros en lo que se refiere a las partes del espectro comprendidas entre el 10 y el 100 por 100 de absorbancia relativa. Este criterio se cumple cuando están presentes los mismos máximos y en ningún punto observado la desviación entre los espectros excede del 15 por 100 de la absorbancia del espectro del ápice del pico.
Si no se cumple alguno de estos criterios, no se confirma la presencia de analito.
60.6.2 Repetibilidad. La diferencia entre los resultados de dos terminaciones paralelas llevadas a cabo con la misma muestra no deberá superar el 10 por 100 relativo al resultado más alto obtenido para contenidos de robenidina superiores a 15 mg/kg.
60.6.3 Recuperación. La recuperación de la muestra en blanco reforzada deberá ser al menos del 85 por 100.
60.7 Resultados de un ensayo colaborativo. La CEE organizó un ensayo colaborativo en el que se analizaron en 12 laboratorios cuatro muestras de piensos para aves y conejos, tanto en forma de harinas como en gránulos. Se efectuaron análisis duplicados de cada muestra y se obtuvieron los siguientes resultados:
Aves: Harina / Gránulo / Conejos: Harina / Gránulo
Media (mg/kg) / 27,00 / 27,99 / 43,6 / 40,1
S (mg/kg) / 1,46 / 1,26 / 1,44 / 1,66
CV (porcentaje) / 5,4 / 4,5 / 3,3 / 4,1
S (mg/kg) / 4,36 / 3,36 / 4,61 / 3,91
CV (porcentaje) / 16,1 / 12,0 / 10,6 / 9,7
Recuperación (Porcentaje) / 90,0 / 93,3 / 87,2 / 80,2
S = Desviación estándar de la repetibilidad.
CV = Coeficiente de variación de la repetibilidad.
S = Desviación estándar de la reproducibilidad.
CV = Coeficiente de variación de la reproducibilidad.
60.8 Referencias. Directiva 93/117/CEE. «Diario Oficial de las Comunidades Europeas» L 329, de 30 de diciembre de 1993.
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